鄭盛武， 賴　丹， 趙肅清

(廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院, 廣東 廣州 510006)

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鄰苯二甲酸二丁酯人工抗原的制備及免疫鑒定

鄭盛武， 賴丹， 趙肅清

(廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院, 廣東 廣州 510006)

摘要：【目的】制備并鑒定1種新型鄰苯二甲酸二丁酯人工抗原。【方法】以4-硝基鄰苯二甲酸為原料，經(jīng)過酯化、還原生成4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯(DBAP)，DBAP再與戊二酸酐反應(yīng)，衍生生成4-戊二酸單酰鄰苯二甲酸二丁酯(DBCP)。將合成的半抗原衍生物DBCP通過活性酯法與牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，得到人工抗原。通過免疫新西蘭大白兔獲得抗血清，經(jīng)間接競爭酶聯(lián)免疫法(icELISA)檢測抗體特異性。【結(jié)果】經(jīng)質(zhì)譜、氫核磁共振譜圖鑒定，半抗原衍生物合成成功，經(jīng)紫外光譜、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫試驗證實偶聯(lián)成功，并計算得出DBCP與載體蛋白BSA和OVA的結(jié)合比分別為11∶1和17∶1。經(jīng)icELISA法檢測，兔1和兔2的血清效價均達(dá)到1∶128 000，IC50分別為301 和308 ng·mL-1，反應(yīng)特異性較好?！窘Y(jié)論】半抗原衍生物的合成是方便、安全的。鄰苯二甲酸人工抗原的成功制備使獲得DBP多克隆抗體以及建立DBP免疫分析方法成為可能。

關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸二丁酯； 人工抗原； 光譜； 免疫鑒定

鄰苯二酸酯類化合物(PAEs)又稱鈦酸酯，是大約30種化合物的總稱，主要用作塑料的增塑劑，以增大塑料的可塑性和強(qiáng)度[1]。鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)是塑化劑的一種，工業(yè)上主要用于硝基漆和聚氯乙烯(PVC)塑料的生產(chǎn)，以增強(qiáng)產(chǎn)品的柔韌性。此外，DBP還用于生產(chǎn)防泡劑、乳膠黏合劑和紡織助劑等[2]。塑化劑的大量生產(chǎn)和頻繁應(yīng)用，導(dǎo)致在人們的日常生活中塑化劑污染嚴(yán)重。據(jù)報道，中國南京市區(qū)的大氣塑化劑污染中，DBP占到了58.7%[3]。DBP是一種具有生殖毒性和遺傳毒性的環(huán)境雌激素，具有雌激素的作用，致突變，對胎兒有毒性，對肌肉、骨骼、中樞神經(jīng)系統(tǒng)有影響，能通過消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和皮膚進(jìn)入人體[4]，對人體產(chǎn)生不同程度的危害作用。有研究發(fā)現(xiàn)，DBP的代謝產(chǎn)物MBP對大鼠具有胚胎毒性作用，導(dǎo)致胚胎生長緩慢，同時對胚胎有致畸作用[5]。

早在1975年，DBP就被世界野生動物基金會列為具有內(nèi)分泌紊亂作用的物質(zhì)之一[6]。DBP還被歐盟2005/84/EC指令限制使用于兒童玩具和用品中，在塑料中的含量不得超過0.1%。美國、加拿大、日本、韓國等多個國家也相繼發(fā)布了與歐盟類似的法律和標(biāo)準(zhǔn)[7]，我國也將其列為優(yōu)先控制污染物黑名單[8]。近年來爆發(fā)的”臺灣塑化劑事件“和“白酒塑化劑事件”，讓人們重新認(rèn)識了作為包裝材料添加劑的“塑化劑”，由此引發(fā)了對食品包裝材料安全性能的高度關(guān)注[9]。目前對塑化劑的檢測方法主要為氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)和質(zhì)譜(MS)等，但這些方法費時，儀器昂貴，需專業(yè)人士操作，樣品前處理復(fù)雜，不能同時大量分析[10]。本研究采用的免疫分析技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷、分析容量大、檢測成本低、安全可靠等優(yōu)點[11]。

小分子物質(zhì)鄰苯二甲酸二丁酯只有反應(yīng)原性，沒有免疫原性，不能刺激動物發(fā)生免疫反應(yīng)。為了獲得具有免疫原性的完全抗原，必須將其與大分子載體進(jìn)行偶聯(lián)[12]。本研究利用戊二酸酐合成了連接有5個碳臂長的半抗原衍生物4-戊二酸單酰鄰苯二甲酸二丁酯(DBCP)，再通過活性酯法將DBCP與載體蛋白——牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)獲得人工抗原，最后利用間接酶聯(lián)免疫法(icELISA)檢測抗體。該抗原的合成為免疫分析技術(shù)的建立奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

4-硝基鄰苯二甲酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%)、鈀碳：百靈威化學(xué)試劑有限公司；高純氫氣：廣州市君多氣體有限公司；二環(huán)乙基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、牛血清蛋白(BSA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.6%)、卵清蛋白(OVA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)、弗氏完全佐劑與不完全佐劑：美國Sigma公司；SPF級雌性新西蘭大白兔：廣東省動物中心；羊抗兔IgG-HRP二抗：武漢博士德生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。TU-1901紫外-可見分光光度儀：北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司；RT-2100C型酶標(biāo)儀：雷杜生命科學(xué)股份有限公司；96孔酶標(biāo)板：廈門云鵬科技有限公司。

1.2人工抗原的合成與鑒定

1.2.14-硝基鄰苯二甲酸二丁酯(DBNP)的合成按照文獻(xiàn)[13]中的方法，稱取20 g(0.095 mol)4-硝基鄰苯二甲酸，加入26 mL正丁醇，攪拌下加入3.3 mL濃H2SO4催化，120 ℃攪拌回流7 h后，蒸餾除去未反應(yīng)的丁醇和生成的水。趁熱導(dǎo)入冰水中，油狀粗品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%Na2CO3洗滌至水層無色(pH7~8)后，分離出油狀物，用無水乙醇溶解除去不溶物，加熱后除去少量乙醇，趁熱置冰箱中冷卻，得到黃色油狀液體28.5 g，產(chǎn)率93%。

1.2.24-氨基鄰苯二甲酸二丁酯(DBAP)的合成取2 g(6.19 mmol)4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯和0.4 g鈀碳溶于15 mL甲醇，緩慢通入H2，50 ℃條件下回流攪拌反應(yīng)5 h，反應(yīng)結(jié)束后過濾，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用乙酸乙酯溶解后再過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后得淡黃色固體1.78 g，產(chǎn)率98%。產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析提純，通過氫核磁共振(1H NMR)和質(zhì)譜(MS)鑒定。

1.2.34-戊二酸單酰鄰苯二甲酸二丁酯 (DBCP) 的合成將0.29 g(1 mmol)DBAP和0.22 g(2 mmol)戊二酸酐溶解在20 mL四氫呋喃(THF)中，60 ℃條件下回流攪拌反應(yīng)8 h，再轉(zhuǎn)移至室溫攪拌反應(yīng)12 h，蒸餾除去THF。殘余物溶于10 mL乙酸乙酯中，并用10 mL雙蒸水洗滌，分離出乙酸乙酯層，轉(zhuǎn)旋蒸發(fā)除去乙酸乙酯，得到黃色油狀液體0.31 g，產(chǎn)率75%。

1.2.4人工抗原的合成將40.7 mg(0.1 mmol)DBCP，17 mg(0.15 mmol)NHS完全溶于1 mL的二甲基甲酰胺(DMF)后，加入31 mg(0.15 mmol)DCC，4 ℃條件下反應(yīng)12 h，離心分離出上清液。取900 μL得到的上清液，滴加到8 mL溶有113 mg BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)中，4 ℃條件下反應(yīng)12 h。10 000 g·min-1條件下離心10 min。將上清液裝入透析袋，用PBS透析3 d，每12 h換液1次，得到棕黃色的鄰苯二甲酸全抗原溶液。

1.2.5人工抗原的鑒定為鑒定半抗原與載體蛋白是否偶聯(lián)成功，分別將半抗原、載體蛋白和偶聯(lián)物稀釋至一定濃度進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，并在200~400 nm波長間進(jìn)行紫外吸收光譜測定，以紫外分光光度法估算偶聯(lián)物的結(jié)合比[14]。

1.3免疫動物及抗血清檢測

以DBCP-BSA作免疫原，用PBS溶液(pH 7.4)稀釋至1 mg·mL-1，與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，對2只成年健康雌性新西蘭大白兔采用背部多點注射和肌肉注射。3周后再次免疫改用等量的弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，以后每隔2周免疫1次，免疫后7~8 d耳緣靜脈取血[15]。

以DBCP-OVA作包被原，將抗血清用PBS溶液倍比稀釋，采用間接ELISA法檢測抗體效價，并用間接競爭ELISA法[16]檢測抗體的特異性。以標(biāo)準(zhǔn)品DBP濃度的自然對數(shù)值為橫坐標(biāo)，D/D0(D、D0分別為加兔抗血清和陰性血清對應(yīng)的光密度)為縱坐標(biāo)，建立競爭抑制曲線。

1.4抗體特異性分析

采用icELISA法分別檢測鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP)、鄰苯二甲酸單芐酯(MBzP)、4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯(DBAP)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DNOP)與抗體的交叉反應(yīng)，并計算各競爭物的半抑制率(IC50)，比較抗體對它們的親和性。根據(jù)以下公式計算各競爭物與DBP抗體的交叉反應(yīng)率[17]。

2結(jié)果與分析

2.1半抗原衍生物合成結(jié)果分析

對半抗原衍生物4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯(DBAP)和4-戊二酸單酰鄰苯二甲酸二丁酯(DBCP)進(jìn)行了質(zhì)譜(MS)與氫核磁共振(1H NMR)掃描，結(jié)果(圖1和圖2)表明合成成功。

圖1　半抗原衍生物DBAP的1H NMR(a)和MS(b)圖譜

由圖1a分析可知，DBAP的1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 7.71 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 6.76~6.65 (m, 2H), 4.27 (dt,J= 17.6, 6.7 Hz, 4H), 1.78 ~1.61 (m, 4H), 1.52~1.37 (m, 4H), 0.96 (t,J= 7.3 Hz, 6H)，其MS圖(圖1b)中293.9是M+H+，315.9是M+Na+，331.9是M+K+，348.1是M+Na++CH3OH，609.1是2M+Na+。由此可知，該化合物的相對分子質(zhì)量為293，與計算結(jié)果吻合。

圖2　半抗原衍生物DBCP的1H NMR(a)和MS(b)圖譜

由圖2a分析可知 DBCP的1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 9.02 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.69 (d,J= 8.0 Hz, 2H), 4.24 (td,J= 6.7, 3.2 Hz, 4H), 2.46 ~2.21 (m, 4H), 2.01 ~ 1.83 (m, 2H), 1.74~ 1.56 (m, 4H), 1.39 (dp,J= 14.4, 7.3 Hz, 4H), 0.92 (q,J= 7.3 Hz, 6H)，其MS圖(圖2b)中，406.2是M-H+。由此可知，該化合物的相對分子質(zhì)量為407.2，與計算結(jié)果吻合。

2.2抗原的鑒定

2.2.1紫外可見光吸收光譜鑒定經(jīng)紫外可見光分光光度計測定，得到載體蛋白、半抗原衍生物以及人工抗原的紫外掃描圖(圖3)。從圖3中可以看出，DBCP在波長204、223和269 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，載體蛋白BSA在波長202和280 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，OVA在205和280 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，而DBCP-BSA則在205和272 nm處有顯著吸收峰，DBCP-OVA在203和269 nm處有顯著吸收峰。由于DBCP的羧基與載體蛋白的氨基發(fā)生偶聯(lián)，所以紫外光譜中特征峰發(fā)生改變，但同時具備半抗原和載體蛋白的吸收特征，間接說明半抗原和載體蛋白偶聯(lián)成功[18]。根據(jù)紫外分光光度法估算DBCP-BSA和DBCP-OVA的結(jié)合比分別為11∶1和17∶1。

2.2.2 SDS-PAGE鑒定人工抗原及蛋白的SDS-PAGE結(jié)果見圖4。由圖4可知，人工抗原的遷移速率均比載體蛋白的遷移速率小，表明偶聯(lián)產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量均比載體蛋白的相對分子質(zhì)量大。其中，DBCP-OVA和OVA在電泳圖中的區(qū)分效果較好，可能是OVA的相對分子質(zhì)量較小、結(jié)合上的DBCP較多的緣故(結(jié)合比17∶1)。電泳圖表明半抗原衍生物與載體蛋白偶聯(lián)成功。

圖3　人工抗原紫外掃描圖

M1:重組蛋白 Marker 1; 1：BSA；2:DBCP-BSA; M2:重組蛋白 Marker 2; 3：OVA; 4:DBCP-OVA。

圖4BSA和DBCP-BSA以及OVA和DBCP-OVA的SDS-PAGE電泳圖

Fig.4SDS-PAGE gel of BSA, DBCP-BSA, OVA and DBCP-OVA

2.3抗血清檢測

對兔子進(jìn)行5次免疫后耳部靜脈采血，經(jīng)離心得到抗血清，利用間接ELISA法檢測抗體效價，結(jié)果見表1。從表1可知，兔1和兔2抗血清效價均達(dá)到1∶128 000。包被抗原DBCP-OVA經(jīng)方陣滴定法確定最佳包被質(zhì)量濃度為2 000 ng·mL-1。以抗血清最高效價稀釋倍數(shù)，利用icELISA法測定其半抑制率(IC50)，競爭抑制曲線如圖5，可知兔1和兔2的IC50分別為301和308 ng·mL-1。

表1抗血清效價測定結(jié)果

Tab.1Detection result of serum titer

血清稀釋度D450nm兔1兔21∶20001.70831.45871∶40001.60131.39751∶80001.41571.16471∶160001.24930.94361∶320001.00500.74571∶640000.73700.41481∶1280000.46800.28531∶1000(陰性對照)0.02800.0303

圖5　DBP標(biāo)準(zhǔn)競爭抑制曲線

Fig.5Standard competitive inhibition curves for DBP

2.4抗體特異性分析

采用icELISA法對鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸單芐酯等鄰苯二甲酸結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果如表2所示。從表2中可以看出，除DBP和DBAP外，其他結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均小于4.3%。因此，表明DBCP-BSA免疫新西蘭大白兔所獲抗體建立的icELISA方法特異性良好。

表2多克隆抗體與DBCP結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)

Tab.2Cross-reactivity of the polyclonal antibody against DBCP related compounds

交叉反應(yīng)物IC50/(nmol·mL-1) 交叉反應(yīng)率/%鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)1.11004-氨基鄰苯二甲酸二丁酯(DBAP)1.764.7鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)>41.3<2.6鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)>42.7<2.6鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP)>34.1<3.2鄰苯二甲酸單芐酯(MBzP)>32.0<3.4鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP)>30.3<3.6鄰苯二甲酸二正辛酯(DNOP)>25.3<4.3

3討論與結(jié)論

半抗原的設(shè)計、半抗原的修飾和人工抗原的合成是制備抗小分子化合物抗體、建立相應(yīng)的免疫分析方法的重要過程。之前的研究中，鄰苯二甲酸二丁酯人工抗原的研究多以4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯為半抗原通過重氮化法與載體蛋白偶聯(lián)制備[3,11,13],這種方法在半抗原制備過程中通常使用苯等有毒有機(jī)溶劑，不利于試驗操作人員的健康。其次，重氮化法的操作有一定的危險性，且步驟比較繁瑣。Wei等[2]在其研究中曾經(jīng)制備帶4個碳鏈的鄰苯二甲酸二丁酯人工抗原，但在其研究中主要將這種抗原作為包被原來使用，并未深入探究這種抗原的免疫活性。

本研究在DBAP的4位氨基上利用戊二酸酐在半抗原與載體之間連接了1條含5個碳的手臂鏈，充分暴露出了半抗原分子的特征結(jié)構(gòu)，而且連接了5個碳手臂鏈，更有利于人工抗原表面突顯半抗原的結(jié)構(gòu)特征，以利于產(chǎn)生具有高特異性的抗體[19]。利用H2還原、鈀碳作催化劑，大大縮短了反應(yīng)時間，避免了使用有毒試劑苯，試驗操作更安全更簡便，也提高了反應(yīng)產(chǎn)率。使用戊二酸酐反應(yīng)與戊二醛法反應(yīng)相比較，產(chǎn)物更穩(wěn)定，副產(chǎn)物少，專一性更強(qiáng)，產(chǎn)率更高。因此，該抗原的合成為下一步建立免疫分析技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

本試驗使用戊二酸酐反應(yīng)合成了半抗原衍生物，經(jīng)質(zhì)譜、氫核磁共振譜圖鑒定，衍生物合成成功。采用活性酯法將半抗原衍生物與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，合成人工抗原，經(jīng)紫外光譜、SDS-PAGE鑒定，偶聯(lián)成功。所得抗體經(jīng)icELISA法檢測知其具有較高靈敏度和較好特異性，可用于鄰苯二甲酸二丁酯含量的測定。

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【責(zé)任編輯李曉卉】

Synthesis and identification of artificial antigen for dibutyl phthalate

ZHENG Shengwu， LAI Dan， ZHAO Suqing

(Department of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006，China)

Abstract：【Objective】 This study was aimed to prepare and identify a new kind of artificial antigen for dibutyl phthalate. 【Method】 Dibutyl 4-aminophthalate (DBAP) was obtained via esterification and reduction of 4-nitrophthalic acid. The hapten derivative monoglutaryl 4-amino-dibutyl phthalate (DBCP) was prepared through DBAP reacting with glutaric anhydride. DBCP was conjugated to bovine serum albumin (BSA) or ovalbumin (OVA) to make artificial immunogen via activated ester method. Then the antiserum of two female New Zealand white rabbits was obtained after injecting with artificial immunogens which were successfully coupled. Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (icELISA) was used to analyze the sensitivity and specificity of the antiserum. 【Result】 The successful synthesis of hapten derivative was identified by mass spectrometry (MS) and1H nuclear magnetic resonance (1H NMR). The successful coupling was proved by ultraviolet spectroscopy (UV) and SDS polyacrylamide gels electrophoresis (SDS-PAGE). Furthermore, the numbers of DBCP molecules per BSA/OVA molecules for two conjugates were 11∶1 and 17∶1 respectively, estimated by ultraviolet spectrophotometry. The icELISA method indicated high specificity for the antiserum with the highest titer being 1∶128 000 for samples from both rabbits, and the IC50being 301 and 308 ng·mL-1respectively. 【Conclusion】 The hapten derivative can be synthesized in a convenient and secure way. The successful synthesis of the artificial antigen for dibutyl phthalate makes it possible to get polyclonal antibodies and establish immunoassay for DBP.

Key words：dibutyl phthalate; artificial antigen; spectrum; immunity identification

中圖分類號：R446.6; O65

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001- 411X(2016)02- 0107- 06

基金項目：國家自然科學(xué)基金(41271340)；廣東省自然科學(xué)基金(2013040013021， S2013030013338)

作者簡介：鄭盛武(1989—)，男，碩士研究生，E-mail:bntzsw@sohu.com；通信作者：趙肅清(1969—)，男，教授，博士，E-mail: sqzhao@gdut.edu.cn

收稿日期：2015- 05- 25優(yōu)先出版時間：2016- 01- 18

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鄭盛武， 賴丹， 趙肅清.鄰苯二甲酸二丁酯人工抗原的制備及免疫鑒定[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016,37(2):107- 112.