趙娟娟+吳榮榮+李志濤

摘要：從河北省棗強(qiáng)縣受重金屬污染的土壤中分離得到2株耐鉛細(xì)菌，即ZQq1和DYq2，耐受鉛離子最高濃度分別為2.0、2.5 mmol/L，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬。2株菌的生物學(xué)特性研究表明，菌株ZQq1和DYq2在pH值4～10之間，鹽度不超過10%時(shí)能夠生長(zhǎng)。菌株ZQq1最適pH值為8，最適生長(zhǎng)溫度42 ℃，最適滲透壓為0%；菌株DYq2最適生長(zhǎng)溫度為42 ℃，最適pH值為8，最適滲透壓為1%。

關(guān)鍵詞：耐鉛細(xì)菌；分離鑒定；生物學(xué)特性；芽孢桿菌

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）04-0215-02

伴隨著我國(guó)工業(yè)程度的加深，重金屬鉛對(duì)環(huán)境的破壞程度越來越嚴(yán)重。鉛可以通過汽車尾氣、印染企業(yè)廢棄物的排放、電池和電子產(chǎn)品的丟棄等各種途徑而傳遞到環(huán)境中，進(jìn)入土壤和地下水中[1]。在被鉛污染的水體和土壤中，生長(zhǎng)的各種生物通過富集作用，經(jīng)過食物鏈傳遞，最終可以使大量鉛進(jìn)入食物鏈的頂端包括人類。蓄積在人體內(nèi)的鉛能對(duì)血液循環(huán)再生系統(tǒng)造成損傷，蓄積到一定的程度時(shí)，人就會(huì)表現(xiàn)出失眠、噩夢(mèng)等癥狀，更有甚者會(huì)引起智力下降[2]。

[JP2]研究表明，微生物可降低環(huán)境中重金屬鉛的生物毒性，在用于土壤重金屬污染鉛的治理等方面的研究均取得了一定的成果[3]。從棗強(qiáng)工業(yè)區(qū)采集土樣，通過逐級(jí)分離篩選耐鉛細(xì)菌并進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化測(cè)定鑒定。通過對(duì)所得菌株的生物學(xué)特性研究，可以初步得出菌株對(duì)環(huán)境的耐受性及在不同環(huán)境中的生長(zhǎng)趨勢(shì)，可為以后在用耐鉛細(xì)菌或與其他方法聯(lián)合使用時(shí)提供理論依據(jù)，以實(shí)現(xiàn)高效、快速、低成本治理鉛污染。[JP]

1材料和方法

1.1材料

土樣，來自河北省棗強(qiáng)縣受重金屬污染的土壤。

1.2設(shè)備

超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、振蕩培養(yǎng)箱（ZD-85，江蘇金壇市醫(yī)療器械廠）、恒溫生化培養(yǎng)箱（LRH-250，上海一恒科技有限公司）、顯微鏡（BME，徠卡顯微系統(tǒng)上海貿(mào)易有限公司）、數(shù)碼生物顯微鏡（N-800M，上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司）、高壓滅菌鍋（MLS-3750，SANYO）。

1.3耐鉛細(xì)菌的分離

取0.1 g的土樣，接入Pb2+濃度0.01 mmol/L的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、140 r/min條件下進(jìn)行富集培養(yǎng)。取稀釋100倍后的富集菌懸液100 μL涂布在Pb2+濃度為0.02 mmol/L的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，每組重復(fù)3次，于37 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況。挑取單菌落在Pb2+濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 mmol/L的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上逐漸劃線分離，經(jīng)過多次純化，得到單菌株。將篩選出的菌株接入2.0、2.5、3.0 mmol/L不同濃度的固體培養(yǎng)基中，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況，并淘汰耐鉛能力差的菌株，篩選出耐鉛能力最強(qiáng)的菌株[4]。

1.4耐鉛細(xì)菌鑒定

1.4.1對(duì)單菌落的大小、形狀等進(jìn)行觀察采用革蘭氏染色法對(duì)菌株進(jìn)行染色并觀察。

1.4.2生理生化特征

主要包括檸檬酸鹽的利用，丙酸鹽的利用，氧化酶、接觸酶、酪氨酸水解、苯丙氨酸脫氫酶實(shí)驗(yàn)，糖醇發(fā)酵、V.P產(chǎn)生、明膠、液化、需氧性測(cè)定等[5]。

1.4.3生物學(xué)特性試驗(yàn)

1.4.3.1耐鉛細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將菌株活化18 h后接種到液體培養(yǎng)基，37 ℃、轉(zhuǎn)速140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。每2 h測(cè)定1次細(xì)菌菌懸浮液的D600 nm值。

1.4.3.2pH值對(duì)耐鉛細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

將菌株活化18 h后，分別接入pH值為4、6、7、8、9、10的液體培養(yǎng)基中，37 ℃、轉(zhuǎn)速140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。測(cè)定不同pH條件下細(xì)菌懸浮液的D600 nm值。

1.4.3.3鹽度對(duì)耐鉛細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

將菌株活化18 h后接入0%、1%、2%、4%、5%、7%、10%鹽度的培養(yǎng)液，37 ℃、轉(zhuǎn)速140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。測(cè)定不同鹽度條件下細(xì)菌懸浮液的D600 nm值。

1.4.3.4不同溫度對(duì)耐鉛細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

將菌株活化 18 h 后接種到液體培養(yǎng)基，在溫度分別為4、25、32、37、42、48、50、60 ℃，轉(zhuǎn)速140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。測(cè)定在不同溫度下的細(xì)菌懸浮液的D600 nm值。

2結(jié)果與分析

2.1耐鉛細(xì)菌的分離

通過對(duì)樣品的分離純化，篩選出2株耐鉛能力強(qiáng)的耐鉛細(xì)菌。1株耐受鉛離子濃度最高為2.0 mmol/L，命名為ZQq1，另外1株耐受鉛離子最高濃度為2.5 mmol/L，命名為DYq2。

2.2耐鉛細(xì)菌的鑒定[HT]

2.2.1耐鉛細(xì)菌菌落特征耐鉛細(xì)菌菌落特征結(jié)果見表1。

2.2.2耐鉛細(xì)菌生理生化特征

細(xì)菌的生理生化特征是鑒定細(xì)菌種類的重要指標(biāo)和依據(jù)，結(jié)果見表2。

根據(jù)表1中2株細(xì)菌的菌落形態(tài)特征和表2以及2株耐鉛細(xì)菌的革蘭氏染色情況，依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第8版），將2株菌ZQq1和DYq2鑒定為芽孢桿菌屬。

2.3耐鉛細(xì)菌的生物學(xué)特性

2.3.1耐鉛細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線

從樣品中篩選出的2株耐鉛細(xì)菌ZQq1和DYq2的生長(zhǎng)曲線見圖1。

由圖1可知，ZQq1在2 h內(nèi)為生長(zhǎng)延遲期，18 h附近達(dá)到穩(wěn)定期，在約32 h D600 nm值開始下降，即過了穩(wěn)定期；DYq2在 2 h 內(nèi)為生長(zhǎng)延遲期，在22 h附近達(dá)到穩(wěn)定期，在約35 h開始進(jìn)入衰亡期。

2.3.2pH值對(duì)耐鉛細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

菌株對(duì)pH值的適應(yīng)

力，在一定程度上也表明了菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。pH值對(duì)耐鉛細(xì)菌ZQq1和DYq2生長(zhǎng)的影響見圖2。由圖2可知，ZQq1和DYq2均在弱堿性（pH值約為8）條件下生長(zhǎng)最好。ZQq1在pH值為4～8的區(qū)間內(nèi)，隨著pH的增大ZQq1生長(zhǎng)逐漸變好，當(dāng)pH值大于10時(shí)ZQq1無法生長(zhǎng)。DYq2在pH值為4～8的區(qū)間內(nèi)，隨著pH值的增大DYq2生長(zhǎng)逐漸變好，當(dāng)pH值小于4時(shí)會(huì)抑制DYq2菌的生長(zhǎng)。

2.3.3鹽度對(duì)耐鉛細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

細(xì)菌對(duì)不同鹽度的適應(yīng)性差異，可以反映出細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。一般的培養(yǎng)基中也會(huì)添加少量鹽以維持滲透壓。由圖3可知鹽度對(duì)2株耐鉛細(xì)菌ZQq1和DYq2生長(zhǎng)的影響。隨著鹽度的增加，ZQq1和DYq2生長(zhǎng)受抑制程度也在增加。ZQq1最適生長(zhǎng)鹽度為1%，DYq2最適生長(zhǎng)鹽度為0。ZQq1耐鹽度極限7%，DYq2耐鹽度已達(dá)到接近于10%。

2.3.4溫度對(duì)耐鉛細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

不同的溫度下細(xì)菌的生長(zhǎng)速率不同，從中也體現(xiàn)出了細(xì)菌對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的一定適應(yīng)能力。溫度對(duì)耐鉛細(xì)菌ZQq1和DYq2的生長(zhǎng)影響見圖4。由圖4可知，隨著溫度的增加2株菌的生長(zhǎng)速率均提高，約42 ℃為最適生長(zhǎng)溫度，ZQq1在4～20 ℃區(qū)間范圍內(nèi)，生長(zhǎng)速率變化比較平緩，而在20～40 ℃區(qū)間變化較大，隨著溫度升高曲線變得平緩，之后陡然下降，在50 ℃時(shí)不能生長(zhǎng)，而DYq2在4 ℃到最適合生長(zhǎng)溫度之間變化趨勢(shì)相同，過了最適生長(zhǎng)溫度下降明顯，在60 ℃時(shí)生長(zhǎng)被抑制。[HT]

3結(jié)論

[JP2]從河北省棗強(qiáng)縣受重金屬污染的土壤中分離出2株耐鉛能力較強(qiáng)的耐鉛細(xì)菌，即ZQq1和DYq2。分別從以下進(jìn)行描述：（1）ZQq1的菌落邊緣整齊，表面光滑，乳白色。菌體桿狀，產(chǎn)生芽孢，革蘭氏陽性，具有運(yùn)動(dòng)性，好氧生長(zhǎng)，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬菌。其在pH值為弱堿性條件下生長(zhǎng)最好，在pH值大于10時(shí)或小于4時(shí)不能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度在42 ℃附近，在50 ℃及以上不能生長(zhǎng)，其菌株在鹽度為7%及以上完全抑制生長(zhǎng)，耐受鉛離子濃度最高2 mmol/L。（2）DYq2的菌落邊緣整齊，表面光滑，乳白色。菌體桿狀，產(chǎn)生芽孢，革蘭氏陽性菌，具有運(yùn)動(dòng)性，好氧生長(zhǎng)，菌體有成鏈趨勢(shì)，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬菌。DYq2在pH值為8時(shí)生長(zhǎng)最好，其能在42 ℃條件下生長(zhǎng)，在 60 ℃ 及以上不能生長(zhǎng)，其菌株不耐鹽，在鹽度10%及以上完全抑制生長(zhǎng)，耐受鉛離子濃度最高為 2.5 mmol/L。

參考文獻(xiàn)：

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