趙璐 吳佩玲 于莉 袁萍 周春梅

[摘要]目的：體外培養(yǎng)鼠根尖乳頭干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞，比較研究腫瘤壞死因子a（TNF-a）對(duì)兩者增殖活性的影響，以期得出在炎癥狀態(tài)下兩者用于牙本質(zhì)再生的可能性。方法：取幼鼠根尖尚未發(fā)育完全的健康下頜牙，用酶消化法獲得根尖乳頭干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞；免疫熒光法鑒定干細(xì)胞表面標(biāo)志物；將含有TNF-a濃度為O、5、10、50ng/ml的培養(yǎng)液加入兩者的第3代細(xì)胞中，使用MTT法檢測(cè)以比較其對(duì)兩種細(xì)胞增殖活性的影響；采用SPSS 11.O軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果：SCAP與PDLSCs均呈長(zhǎng)梭形，形似成纖維細(xì)胞；SCAP與PDLSCs均表達(dá)干細(xì)胞特性；SCAP較PDLSCs具有更強(qiáng)的增殖活性；在lOng/ml和50ng/ml濃度時(shí)，TNF-a能促進(jìn)2種細(xì)胞的增殖。結(jié)論：與PDLSCs比較，SCAP增殖活性更強(qiáng)，在炎性環(huán)境下亦是如此，根尖乳頭干細(xì)胞可能在年輕恒牙根尖周炎癥經(jīng)適當(dāng)治療后牙根繼續(xù)發(fā)育中起到重要作用。

[關(guān)鍵詞]TNF-a；根尖乳頭細(xì)胞；牙周膜細(xì)胞：MTT法；增殖；免疫熒光法

[中圖分類號(hào)]R781

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455 （2016）01-0034-03

許多臨床病例發(fā)現(xiàn)，己發(fā)生根尖周炎的年輕恒牙，通過(guò)嚴(yán)格的根管清理，刺激根尖區(qū)組織出血，封閉數(shù)月后可觀察根尖部分有新的硬組織形成，根尖孔閉合。但經(jīng)過(guò)清理的根管中，不可能有牙髓細(xì)胞的存在。自Sonoyam從阻生智齒的根尖乳頭中分離得到根尖乳頭干細(xì)胞（stemcells from apicalpapilla，SCAP），其具有的高度增殖能力、自我更新能力和多向分化的潛能迅速使其成為牙本質(zhì)再生及牙根發(fā)育的焦點(diǎn)。有學(xué)者將SCAP與HA/TCP復(fù)合培養(yǎng)后移植到免疫缺陷的小鼠皮下，觀察到皮下有牙髓牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)形成。 據(jù)此可以推測(cè)，當(dāng)患有根尖周炎癥的年輕恒牙無(wú)牙髓細(xì)胞存在時(shí)，很有可能是SCAP促使根尖繼續(xù)發(fā)育。但發(fā)育期根尖端組織涉及的干細(xì)胞種類眾多，影響因素復(fù)雜，故還無(wú)法完全確定。本研究選取幼鼠根尖尚未發(fā)育完全的健康下頜牙，分離其根尖乳頭組織和牙周膜組織進(jìn)行培養(yǎng)，并模擬炎性環(huán)境，用炎性因子TNF-a對(duì)根尖乳頭干細(xì)胞（SCAP） 和牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）進(jìn)行干預(yù)，研究比較炎性因子對(duì)兩者增殖活性的影響，以進(jìn)一步探討SCAP在年輕恒牙發(fā)生根尖周炎時(shí)促進(jìn)牙根發(fā)育的可能性。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

a-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、PBS、青霉素/鏈霉素溶液、I型膠原酶、Vit C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉（β-Glycerophosphate Na2 Salt）、鼠腫瘤壞死性因子（TNFa）、0.25胰酶（Trypsin）、噻唑藍(lán)（MTT）、多聚甲醛、抗STR0-1多克隆抗體、二甲基亞砜（DMSO）、倒置相差顯微鏡、熒光正置顯微鏡及照相系統(tǒng)、37℃細(xì)胞培養(yǎng)孵箱、96孔板、酶標(biāo)儀、超凈工作臺(tái)。

1.2 組織來(lái)源

4周齡Wistar大鼠5只，體重（60±5）g，飼養(yǎng)級(jí)別為清潔級(jí)，口腔牙周牙體狀況良好，遺傳背景清楚明確。

1.3 鼠SCAP和PDLSCs的分離培養(yǎng)和鑒定

參照郭俊等的方法取幼鼠根尖尚未發(fā)育完全的健康下頜牙，用含1%雙抗的PBS反復(fù)沖洗，無(wú)菌條件下鈍性分離根尖部的牙乳頭組織，再用刮匙刮取牙根中1/3的牙周膜組織，剪碎后分別置于15ml的離心管中，加入含3mg/ml I型膠原酶，37℃恒溫水浴消化50min，持續(xù)振蕩至完全消化；800rpm/min離心5min，棄上清液，加入含10%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)液后，分別均勻接種到10c㎡的培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO₂條件下培養(yǎng)，每隔3d換液。觀察細(xì)胞接近融合時(shí)，消化、傳代。采用免疫熒光法鑒定STRO-I的表達(dá)，確定兩者的干細(xì)胞特性。

1.4 TNF-a對(duì)鼠SCAP和PDLSCs增殖的影響

取第3代的SCAP和PDLSCs消化制成單細(xì)胞懸液，分別以200個(gè)/孔的濃度接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24h后，待大部分細(xì)胞貼壁伸展，棄孔內(nèi)殘液，更換無(wú)血清a-MEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)6h后，棄殘液，分別加入含TNF-a濃度為O、5、10、50ng/ml的培養(yǎng)液于96孔板中，每種濃度4復(fù)孔，設(shè)調(diào)零孔，每2d換液，第4天終止培養(yǎng)。避光條件下每孔加入MTT（5mg/ml），37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄培養(yǎng)液，每孔加150μl DMSO，持續(xù)振蕩lOmin后，于酶聯(lián)免疫儀檢測(cè)490nm波長(zhǎng)處各孔光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSSll.0軟件包，對(duì)細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），比較各組間樣本均數(shù)的差異，P

2 結(jié)果

2.1 鼠SCAP和PDLSCs的生長(zhǎng)及形態(tài)觀察

原代培養(yǎng)3d后，倒置顯微鏡下可觀察到SCAP向組織周圍游離生長(zhǎng)出來(lái)。細(xì)胞形態(tài)多數(shù)呈長(zhǎng)梭形，少數(shù)為多角形、紡錘狀或橢圓形，體積較?。▓D1），每3d全量換液，6-8d后傳代，傳代后細(xì)胞整體呈漩渦狀排列。加入TNF-a后，SCAP細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變，但細(xì)胞密度明顯增加。

原代PDLSCs形態(tài)與SCAP形態(tài)相似，呈成纖維細(xì)胞樣的梭形結(jié)構(gòu)，但體積較SCAP短?。▓D2），傳代后呈漩渦狀生長(zhǎng)。加入TNF-a后，PDLSCs細(xì)胞形態(tài)亦未發(fā)生明顯改變。

2.2 干細(xì)胞特征的鑒定

免疫熒光法鑒定，鼠SCAP和PDLSCs均呈STRO-1強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（圖3、圖4），符合間充質(zhì)來(lái)源的干細(xì)胞的特性。

2.3 TNF-a對(duì)鼠SCAP和PDLSCs增殖的影響

TNF-a作用兩種細(xì)胞4d后，TNF-a對(duì)SCAP和PDLSCs增殖活性的影響結(jié)果見(jiàn)表1。在lOng/ml和50ng/ml濃度時(shí)，TNF-a能明顯促進(jìn)SCAP和PDLSCs的增殖，與對(duì)照組O濃度相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而每種細(xì)胞在lOng/ml和50ng/ml濃度時(shí)，TNF-a的2種濃度組的組間比較，無(wú)顯著差別（P>0.05）。在未加入TNF-a時(shí)，SCAP較PDLSCs具有較強(qiáng)的增殖活性（P<0.05）。

3 討論

眾所周知，臨床上患有根尖周炎的恒牙，在經(jīng)過(guò)徹底清理，系統(tǒng)的根管治療后，根管中是不可能存在牙髓細(xì)胞的。而通常在臨床上遇到患有根尖周炎癥的年輕恒牙時(shí)，醫(yī)師們一般使用氫氧化鈣以達(dá)到根尖誘導(dǎo)的目的。此方法在不同病例上獲得的效果不一。研究發(fā)現(xiàn)年齡小、病史較短的患牙的治療效果較好，究其原因可能是病史較長(zhǎng)的患牙根尖部形成硬組織的細(xì)胞受到破壞。但近年來(lái)許多病例發(fā)現(xiàn)：患有根尖周炎的年輕恒牙，在經(jīng)過(guò)根管治療后，牙根持續(xù)發(fā)育成形，且部分病例牙髓活力測(cè)試有反應(yīng)。據(jù)此，有學(xué)者提出了“血管重建假說(shuō)”，他們認(rèn)為之所以年輕恒牙發(fā)生炎癥后牙根仍能夠繼續(xù)發(fā)育是因?yàn)槠鋼碛袑挻蟮墓芮?，?dāng)發(fā)生根尖周疾病時(shí)，由于通暢的血液循環(huán)，根尖處也許仍存在部分干細(xì)胞，可發(fā)生牙髓再生及根尖成形。據(jù)此可推測(cè)發(fā)育期牙根的根端組織可能作為牙根發(fā)育的生長(zhǎng)和調(diào)控中心，并長(zhǎng)期存在于發(fā)育期牙根的根端。SCAP的問(wèn)世正好證實(shí)了這一假說(shuō)。與牙髓干細(xì)胞（DPSCs）相比，其增殖能力、端粒酶活性及細(xì)胞遷移能力均強(qiáng)于DPSCs。但由于根端組織涉及的干細(xì)胞非常多，如上皮根鞘細(xì)胞、根尖乳頭干細(xì)胞、牙囊干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞等，故還無(wú)法完全確定。同時(shí)，患有根尖周炎癥的年輕恒牙，根端組織暴露于炎癥環(huán)境下，故了解根端組織的干細(xì)胞在炎癥環(huán)境下的生物學(xué)特性尤為重要。本研究模擬體內(nèi)炎癥環(huán)境，用炎性因子TNF-a對(duì)根尖乳頭干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，對(duì)比研究TNF-a對(duì)兩者增殖影響。

腫瘤壞死因子a（TNF-a）是一種由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎性介質(zhì)，在發(fā)生齲病、牙髓炎及根尖周炎的組織中高表達(dá)，而健康組織幾乎不表達(dá)，是參與炎癥發(fā)生發(fā)展十分重要的一種細(xì)胞因子。Yang H等發(fā)現(xiàn)TNF-a可促進(jìn)SCAP細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示在lOng/ml和50ng/ml兩種濃度的TNF-a對(duì)SCAP和PDLSCs的增殖均有明顯的促進(jìn)作用，但對(duì)同一細(xì)胞的兩種濃度間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一特點(diǎn)為牙組織工程學(xué)優(yōu)良種子細(xì)胞的篩選提供了廣闊的前景；對(duì)年輕恒牙根尖周炎癥的治療帶來(lái)了新的希望。但由于本實(shí)驗(yàn)涉及的實(shí)驗(yàn)對(duì)象為Wistar大鼠，無(wú)法確定TNF-a對(duì)于人的牙齒與鼠的影響是否具有差異，故在炎癥條件下根尖乳頭干細(xì)胞促使人牙本質(zhì)再生的效果，還需進(jìn)一步進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)。