李亞玲 張偉 梁惠宇 周陸陸 姚永明 唐勝建

[摘要]目的：研究外源性microRNA-130a在卵巢顆粒細(xì)胞KGN中過表達(dá)對(duì)FOXL2基因表達(dá)的影響，探索microRNA-130a對(duì)KGN細(xì)胞增殖的影響。方法：人工設(shè)計(jì)合成靶向FOXL2基因的microRNA-130a模擬物，脂質(zhì)體法將microRNA-130a模擬物轉(zhuǎn)染入KGN細(xì)胞中，Trizol法和RIPA蛋白裂解法分別獲取高純度的細(xì)胞總RNA和總蛋白，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)（FQ-PCR）檢測(cè)microRNA模擬物轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中FOXL2基因mRNA表達(dá)水平，Western Blot檢測(cè)FOXL2蛋白表達(dá)水平，四甲基偶氮唑鹽法（MTT）檢測(cè)microRNA-130a轉(zhuǎn)染后KGN細(xì)胞的增殖情況。 結(jié)果：成功轉(zhuǎn)染KGN細(xì)胞后，陰性對(duì)照組FOXL2基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平與空白對(duì)照組相比無明顯的差異（P>0.05），miR-130a轉(zhuǎn)染組能顯著抑制FOXL2 mRNA和蛋白的表達(dá)，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。MTT法檢測(cè)各組KGN細(xì)胞的OD值及細(xì)胞增值率，microRNA-10a轉(zhuǎn)染后能明顯促進(jìn)KGN細(xì)胞的增殖，與與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。結(jié)論：外源性的miR-130a對(duì)FOXL2基因mRNA和蛋白表達(dá)有明顯的抑制作用，且能明顯促進(jìn)KGN細(xì)胞的增殖。

[關(guān)鍵詞] miR-130a；轉(zhuǎn)染；KGN細(xì)胞：FOXL2；基因表達(dá)調(diào)控；細(xì)胞增殖

[中圖分類號(hào)]Q813.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2016）01-0030-04

FOXL2是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，主要表達(dá)在眼周、卵巢和垂體細(xì)胞中，該基因最早由Crisponi作為小瞼裂綜合征（BPES，Blepharophimosis Syndrome，MIM： 110100）及卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）的候選基因被克隆定位Ⅲ。小瞼裂綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，臨床上以瞼裂狹小，上瞼下垂，反向性內(nèi)眥贅皮和內(nèi)眥遠(yuǎn)距為主要征象，BPES根據(jù)是否存在卵巢早衰分為兩型，I型合并有卵巢早衰（premature ovarianfailure，POF），II型只表現(xiàn)為眼瞼畸形，超過2/3的BPES患者攜帶有FOXL2的基因內(nèi)突變，此外FOXL2的雜合突變還能導(dǎo)致卵巢功能早衰和女性不孕。FOXL2作為轉(zhuǎn)錄因子功能的發(fā)揮需要FOXL2基因本身的磷酸化激活，發(fā)生FOXL2基因突變的體細(xì)胞FOXL2功能失活，研究證實(shí)FOXL2基因突變能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，以及抑制細(xì)胞的凋亡。

microRNA是生物體內(nèi)源長(zhǎng)度約為21-25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA[7]，microRNA通過與靶mRNA的3端非編碼區(qū)域（3-untranslatedregion，3UTR）互補(bǔ)配對(duì)導(dǎo)致mRNA的翻譯抑制或降解，從而在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控。microRNA對(duì)維持生物體正常的生理功能具有重要的意義，microRNA在體內(nèi)的異常表達(dá)與人類許多疾病有關(guān)，包括一些精神疾以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等，生物信息學(xué)研究表明生物體內(nèi)超過60%的蛋白編碼基因受體內(nèi)靶向microRNA的調(diào)控。

鑒于microRNA對(duì)基因的調(diào)控功能以及FOXL2是小瞼裂綜合癥的致病基因，本研究利用生物信息學(xué)研究工具篩查出在小瞼裂綜合癥中異常表達(dá)的microRNA，人工設(shè)計(jì)合成miR-130a mimics，將miR-130a mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入卵巢顆粒細(xì)胞KGN中，研究miR-130a mimics對(duì)FOXL2基因表達(dá)的調(diào)控作用，以及對(duì)KGN細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

KGN細(xì)胞株由濰坊醫(yī)學(xué)院整形外科實(shí)驗(yàn)室保存，DMEM培養(yǎng)液、OptiMEM ReducedSerum Medium、Lipofectamine3000 Reagent、新生牛血清、MTT細(xì)胞增殖試劑均購(gòu)自美國(guó)GIBCO（Invrotrigen）公司。microRNAmlmics由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司提供，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNAeraser（Perfect Real Time）和熒光定量PCR試劑MightyAmpfor Real Time（SYBR Plus）（2×）均購(gòu)自日本的Takara公司，Western Blot抗FOXL2基因的一抗、二抗均購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人卵巢顆粒細(xì)胞癌KGN細(xì)胞株貼壁生長(zhǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO₂恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)選取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光顯微鏡觀察：實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（microRNA-130a Negative controlmlmics組）和microRNA-130a mimics轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染前24h將KGN細(xì)胞以1×lOb-3×105的數(shù)目接種于6孔板中，以每孔7.5μl的lip3 000和7.5μg的microRNA mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)染8h、12h、24h、36h、48h，取出6孔板在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：轉(zhuǎn)染48h后收集每孔中的KGN細(xì)胞，按Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，用微量分光光度計(jì)測(cè)量RNA的濃度和純度，設(shè)計(jì)20μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中獲得的cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)對(duì)照，設(shè)計(jì)25μl PCR擴(kuò)增體系，在熒光定量PCR儀按98℃5min，98℃30s，60℃30s，68℃30s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，以2-△△Ct表示目的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上。

1.2.4 Western Blot檢測(cè)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收集各孔KGN細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取蛋白25μg/孔，以10%SDSPAGE跑膠分離，轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫封閉2h，以FOXL2和GAPDH為一抗（抗體稀釋比例分別為1∶5000和1∶500），4℃孵育過夜，洗膜，過氧化物酶耦聯(lián)的二抗（稀釋比例均1∶500）室溫標(biāo)記1h，ECL法顯影，掃描曝光后的膠片，采用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白FOXL2和內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值的比值表示目的蛋白FOXL2的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：取指數(shù)生長(zhǎng)期的KGN細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，按3×10¹⁰細(xì)胞/孔的濃度接種于96孔板中，置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染microRNA mimics入細(xì)胞中。分別于轉(zhuǎn)染0、24、48和72h，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。吸去待測(cè)細(xì)胞上清液，加入180 ll1無血清培養(yǎng)液，再加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清液，每孔加入100μlDMSO，置于搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度（OD）值，以細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組OD值/陰性對(duì)照組OD值，繪制KGN細(xì)胞增殖率曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為a=0.05，以P

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡觀察結(jié)果

熒光顯微鏡下，可見2種質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染8h后即可出現(xiàn)清晰的綠色熒光，24h后發(fā)生綠色熒光的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步增加，48h后達(dá)到最高峰，72h時(shí)熒光數(shù)量下降（圖1）。

2.2 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組FOXL2的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），miR130a轉(zhuǎn)染組FOXL2 mRNA的表達(dá)量明顯下降，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。

2.3 Western Blot檢測(cè)結(jié)果

蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組FOXL2蛋白的表達(dá)量下降了8.796，表達(dá)量無明顯的下降，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），miR-130a轉(zhuǎn)染組FOXL2蛋白的表達(dá)量與空白對(duì)照組相比下降了40.9%，與陰性對(duì)照組相比下降了35.3%，與空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。

2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組組比較，陰性對(duì)照組KGN細(xì)胞的增殖能力無明顯的改變（圖3），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-130a mimics轉(zhuǎn)染組能顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖，與空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

3 討論

microRNA作為一類可調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性小分子RNA，在多種疾病中發(fā)揮重要作用，microRNA調(diào)控基因表達(dá)的功能與來源無關(guān)，microRNA調(diào)控體內(nèi)大部分的蛋白編碼基因，WANG等研究報(bào)道利用分子生物學(xué)工具預(yù)測(cè)到整個(gè)miR30家族成員都參與FOXL2基因的調(diào)控，且在COV434細(xì)胞系中敲除Ag02能夠上調(diào)FOXL2基因的表達(dá)，這項(xiàng)研究進(jìn)一步說明，microRNA參與FOXL2基因的表達(dá)，且在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)miR_30a下調(diào)FOXL2基因的表達(dá)，miR30a通過抑制FOXL2基因的表達(dá)，上調(diào)BCL2AI和IER3基因的表達(dá)16。Dai等研究表明microRNA-133b參與FOXL2的表達(dá)，能夠通過抑制FOXL2基因的表達(dá)上調(diào)雌激素合成相關(guān)基因CYP19AI和StAR的表達(dá)，從而促進(jìn)雌激素的合成。

鑒于microRNAs參與FOXL2基因的表達(dá)調(diào)控，本研究通過生物信息學(xué)工具篩查出在小瞼裂綜合征中異常表達(dá)的microRNA，人工設(shè)計(jì)合成microRNA-130a mimics，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入KGN細(xì)胞中，研究microRNA-130a mimics對(duì)FOXL2基因的表達(dá)調(diào)控，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在KGN細(xì)胞中過表達(dá)microRNA-130a能夠顯著抑制FOXL2基因的表達(dá)，F(xiàn)OXL2mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著下降，說明microRNA-130a參與FOXL2基因的調(diào)控，己知FOXL2基因與人類的小瞼裂綜合征以及卵巢早衰等疾病有關(guān)，參與人類的顱面部和生殖系統(tǒng)的發(fā)育，F(xiàn)OXL2是第一個(gè)被認(rèn)定在維持卵巢功能中具有重要作用的常染色體基因，也是性別決定和分化的標(biāo)記，F(xiàn)OXL2的突變可引起B(yǎng)PES和卵巢早衰。各種研究表明該基因在生物體中作用的發(fā)揮受到其自身表達(dá)調(diào)控的影響，而對(duì)其表達(dá)調(diào)控的研究和探索將為查明其作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，本研究利用外源性microRNA-130a對(duì)FOXL2基因進(jìn)行調(diào)控，為小瞼裂綜合征的致病基因調(diào)控提供新的研究思路。

microRNA參與細(xì)胞的增殖調(diào)控，趙等研究發(fā)現(xiàn)，miR20a在宮頸癌患者中的表達(dá)較正常人高，能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖，分化與遷移。Uda等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXL2突變體小鼠的卵巢中濾泡細(xì)胞閉鎖，表明該基因在某種程度上有抗細(xì)胞凋亡的作用。FOXL2作為轉(zhuǎn)錄抑制因子能夠抑制BCL2AI、IER3和cyclinD2基因在卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)，BCL2AI和IER3是細(xì)胞凋亡抑制因子，cvclinD2是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因，能夠促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變。WANG等研究報(bào)道m(xù)iR30a通過抑制FOXL2基因的表達(dá)促進(jìn)BCL2AI、IER3和cvclinD的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，在睪丸腫瘤和卵巢腫瘤中BCL2AI、IER3和cyclinD2基因處于高表達(dá)狀態(tài)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無限增殖?；诖耍狙芯吭趍icroRNA-130a過表達(dá)能顯著抑制FOXL2基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，又進(jìn)一步探討microRNA-130a過表達(dá)對(duì)KGN細(xì)胞的增殖影響，MTT法檢測(cè)結(jié)果表明microRNA-130a過表達(dá)能夠明顯促進(jìn)KGN細(xì)胞增殖，已知卵巢顆粒細(xì)胞參與了卵泡的發(fā)生以及雌激素的合成，卵泡細(xì)胞閉鎖能夠?qū)е侣殉苍缢ィ瑥亩l(fā)女性的閉經(jīng)、不孕不育以及一系列由于體內(nèi)雌激素缺乏所引起的癥狀，如潮熱多汗、面部潮紅等，卵巢顆粒細(xì)胞的增殖能夠減緩卵泡細(xì)胞的閉鎖，最重要的是能夠促進(jìn)雌激素的合成，能明顯緩解體內(nèi)雌激素缺乏所引起的一系列臨床癥狀。

綜上所述，本研究結(jié)果表明在卵巢顆粒細(xì)胞KGN中過表達(dá)microRNA-130a，能夠顯著抑制FOXL2基因的表達(dá)，并能有效促進(jìn)KGN細(xì)胞的增殖，揭示了microRNA-130a、FOXL2以及細(xì)胞增殖之間的關(guān)系，microRNA-130a對(duì)FOXL2基因的表達(dá)調(diào)控不僅為FOXL2的突變研究提供新的思路，還為FOXL2基因缺陷性疾病小瞼裂綜合征的治療提供新的治療方向，microRNA-130a通過抑制FOXL2的表達(dá)促進(jìn)KGN細(xì)胞的增殖，與FOXL2基因的低表達(dá)發(fā)揮協(xié)同作用，共同促進(jìn)雌激素的合成，雌激素合成量的增加能夠有效緩解小瞼裂綜合征I型中的卵巢早衰癥狀。microRNA-130a對(duì)FOXL2的表達(dá)調(diào)控具有重要的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值及臨床應(yīng)用價(jià)值，而關(guān)于microRNA-130a通過何種機(jī)制促進(jìn)KGN細(xì)胞的增殖則需要進(jìn)一步的研究探索。