閆成玉，王中師，關(guān)景麗，張榮梅

鉤藤總堿預(yù)處理對小鼠急性腦梗死模型神經(jīng)元活性的影響＊

閆成玉，王中師，關(guān)景麗，張榮梅＊

目的 考察鉤藤總堿對急性腦梗死和腦缺氧的作用。方法用光化學(xué)方法制作腦梗死動物模型，用連二亞硫酸鈉制作化學(xué)缺氧細(xì)胞模型。結(jié)果鉤藤總堿預(yù)處理能減輕腦梗死面積并對抗皮層神經(jīng)元缺氧。結(jié)論鉤藤總堿對中樞神經(jīng)元有保護(hù)作用。

鉤藤總堿；腦梗死；神經(jīng)元

鉤藤是茜草科植物，其莖葉是中醫(yī)治療“肝陽上亢”的主要藥物［1］，主要成分鉤藤總堿有抗驚厥和抗高血壓的作用。研究表明，鉤藤總堿對大鼠海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用［2］，中醫(yī)臨床認(rèn)為以鉤藤總堿為主要成分的方劑天麻鉤藤飲對缺血性腦病有防治作用。本實(shí)驗(yàn)考察了鉤藤總堿預(yù)處理對小鼠急性腦梗死模型的作用并在細(xì)胞水平考察了鉤藤總堿對神經(jīng)元活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 昆明種小白鼠和新生Wistar大鼠（購自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，清潔級，合格證號魯動質(zhì)字20141024）。

1.2 試劑和儀器 鉤藤總堿 （解放軍88醫(yī)院藥劑科制劑室提取自鉤藤Uncaria thynchophulla Miq. Jacks）；四氯四碘熒光素鈉 （玫瑰紅），伊文思藍(lán)，2，3，5-三苯氯化四氮唑（TTC），連二亞硫酸鈉（購自美國SIGMA公司）；CCK-8試劑盒 （上海博谷生物科技公司）；LG150型冷光源（徐州恒發(fā)有限公司），腦立體定位儀（江灣Ⅱ型），酶標(biāo)儀（山東高密儀器廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 急性腦梗死模型及其測定 小鼠腹腔注射水合氯醛（0.4 g/kg）麻醉，尾靜脈注射四氯四碘熒光素鈉（75 mg/kg），固定于腦立體定位儀上，暴露頭骨，在前后囟之間緊貼顱骨覆蓋有2 mm圓孔的屏蔽紙，孔的右緣距正中線1 mm，冷光源頭緊貼顱骨照射10 min，舌下靜脈注射伊文思藍(lán)（0.1 g/kg）。4 h后取腦。以光照中心為中心，分別向頭尾端各做3個(gè)1 mm厚的冠狀切片，置2%TTC溶液中，37℃水浴0.5 h，4%多聚甲醛固定24 h，掃描儀采集腦片圖像，用BI-2000圖像分析系統(tǒng)測量梗死面積，根據(jù)腦片厚度計(jì)算腦梗死體積。

1.3.2 神經(jīng)元缺氧及其測定 新生Wistar大鼠，75%乙醇麻醉取腦，取部分皮層組織，用含0.25%胰蛋白酶的人工腦脊液消化30 min，轉(zhuǎn)移到種植液中用滴管吹打使之分散均勻，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞按1×105/ml的密度接種在有培養(yǎng)基的96空板中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱里。48 h后分別用濃度0.0（不含化學(xué)缺氧劑）或0.2 mmol/L的連二亞硫酸鈉人工腦脊液溶液進(jìn)行缺氧處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按試劑盒說明加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。450 nm波長下，在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光值（A值）。計(jì)算細(xì)胞存活率（%）=（各實(shí)驗(yàn)組A／細(xì)胞對照組A）×100%。

1.3.3 鉤藤總堿預(yù)處理 在制作腦梗死模型前一天，按照0，5.0，50.0 mg/kg體重給小鼠腹腔注射鉤藤總堿生理鹽水溶液1 ml；或在大鼠皮層神經(jīng)元加入連二亞硫酸鈉前加入含鉤藤總堿的人工腦脊液，使鉤藤總堿（按鉤藤堿計(jì)）的含量分別為0，0.05，0.50 mmol/L。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)分組和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 制作急性腦梗死的小鼠30只，隨機(jī)分為3組，即空白對照組、鉤藤總堿低劑量組 （給藥5.0 mg/kg）和高劑量組 （給藥50.0 mg/kg）；缺氧皮層神經(jīng)元30孔，即空白對照、鉤藤總堿低劑量組（給藥0.05 mmol/L）和高劑量組（給藥0.50 mmol/L）。單因素方差分析比較組間指標(biāo)（腦梗死面積平均值和細(xì)胞存活率平均值）差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 小鼠腦梗死形成和大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧損傷見圖1、2。

圖1 小鼠玫瑰紅腦梗死模型

圖2 連二亞硫酸鈉導(dǎo)致的皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧損傷

2.2 鉤藤總堿預(yù)處理對急性腦梗死和神經(jīng)元的保護(hù)作用 見表1。

表1 鉤藤總堿預(yù)處理對急性腦梗死和神經(jīng)元的作用

3 討論

腦梗死的原因很多，如興奮性氨基酸毒性、氧自由基毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎性損傷或凋亡基因的表達(dá)等，但最常見的原因是腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元缺血缺氧損傷。本實(shí)驗(yàn)用光化學(xué)誘導(dǎo)建立腦梗死動物模型［3］：四氯四碘熒光素鈉（玫瑰紅）為一種無毒染料，不能透過血腦屏障，在冷光的照射下產(chǎn)生自由基，使血管內(nèi)皮細(xì)胞不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，直接損害血管內(nèi)皮的完整性，使血小板黏附于血管內(nèi)皮表面并發(fā)生釋放反應(yīng)，激發(fā)凝血過程，導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成導(dǎo)致腦梗死［4］。這時(shí)給予伊文思藍(lán)，會透過血管屏障進(jìn)入組織間，顯示與照射范圍大致相同的梗死灶?？梢娖湓硎抢米杂苫拘陨裳?，使腦供血供氧不足導(dǎo)致腦梗死。體外實(shí)驗(yàn)則是利用連二亞硫酸鈉的耗氧作用導(dǎo)致神經(jīng)元缺氧死亡。目前的結(jié)果表明，鉤藤總堿預(yù)處理能緩解腦梗死和神經(jīng)元缺氧損傷，而且有劑量依賴性。

已知鈣拮抗藥有擴(kuò)張腦血管的作用，對神經(jīng)元也有保護(hù)作用。鉤藤生物堿具有抑制鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)、擴(kuò)張血管及對心房產(chǎn)生負(fù)性變時(shí)和變力等鈣拮抗藥特征［5］，所以考慮鉤藤總堿對急性腦梗死和神經(jīng)元的保護(hù)作用與鈣拮抗作用有關(guān)。

［1］胡小勤，曾學(xué)文，唐亞平，等.補(bǔ)陽還五湯、天麻鉤藤飲與高血壓病氣虛血瘀證、肝陽上亢證關(guān)聯(lián)性研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（18）：203-205.

［2］劉 衛(wèi)，張兆芹，趙曉民，等.鉤藤總堿預(yù)處理對海馬神經(jīng)元急性缺氧的保護(hù)作用［J］.中國中藥雜志，2006，31（9）：763-765.

［3］盧寶全，尚小明，楊 峰，等.應(yīng)用手持激光器建立光化學(xué)法腦梗死動物模型［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（9）：63-67.

［4］高 莉，彭曉明，霍仕霞.類葉升麻苷對缺糖缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］.中成藥，2015，27（8）：1821-1823.

［5］李晶晶，湯建林，胡嵐嵐，等.鉤藤總堿對焦慮模型行為學(xué)和腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（3）：237-240.

［2016－02－13收稿，2016－03－11修回］ ［本文編輯：劉一洋］

Effects of rhynchophylla total alkaloids pretreatment on acute cerebral infarction and on activity of anoxia neurons

YAN Cheng-Yu，WANG Zhong-Shi，GUAN Jing-Li，et al.Dept.of Pharmacy，No.88 Hospital of Chinese PLA，Tai'an，Shandong 271000，China

ObjectiveTo investigate the effects of rhynchophylla total alkaloids pretreatment on acute cerebral infarction and on anoxia.MethodsActinochemistry method was used to set up an acute cerebral infarction model in mice and sodium dithionite was used to establish an anoxia model in neurons.ResultsInfarction was alleviated by rhynchophylla total alkaloids pretreatment and it also resisted anoxia injury in mice cerebral neurons.ConclusionRhynchophylla total alkaloids can protect CNS neurons from infraction or hypoxia.

Rhynchophylla total alkaloids；Cerebral infarction；Neuron

R285.5

A

10.14172/j.issn1671-4008.2016.08.021

山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2008GG2NS02006）

271000山東泰安，解放軍88醫(yī)院（閆成玉，張榮梅）；264200山東威海，威海市立醫(yī)院（王中師）；271000山東泰安，泰安中心醫(yī)院（關(guān)景麗）

張榮梅，Email：18254887116@qq.com