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苦參堿對(duì)人膀胱癌BIU-87/ADM細(xì)胞多藥耐藥的影響

左陵君，張?jiān)判?，段建?br/>蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，甘肅 蘭州 730030

摘要：目的探討苦參堿對(duì)人膀胱癌BIU-87/ADM細(xì)胞多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用的機(jī)制。方法MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率；熒光分光光度計(jì)檢測阿霉素（ADM）的蓄積和外排；免疫印跡法檢測P-糖蛋白（P-gp）表達(dá)；P-gp-GloTMAssay System試劑盒檢測P-gp ATP酶活性。結(jié)果經(jīng)ADM作用后，與敏感細(xì)胞株BIU-87存活率比較，耐藥細(xì)胞株BIU-87/ADM存活率明顯增加（P＜0.001），苦參堿呈劑量依賴地降低BIU-87/ADM細(xì)胞存活率（P＜0.01），而對(duì)敏感細(xì)胞株BIU-87細(xì)胞存活率無顯著影響。苦參堿呈劑量依賴地增加ADM在BIU-87/ADM細(xì)胞中蓄積水平，抑制ADM細(xì)胞內(nèi)外排?？鄥A明顯抑制P-gp蛋白表達(dá)，降低P-gp ATP酶活性。結(jié)論苦參堿通過抑制BIU-87/ADM細(xì)胞P-gp蛋白和ATP酶活性，減弱P-gp外排功能，增加細(xì)胞內(nèi)ADM蓄積，從而發(fā)揮對(duì)人膀胱癌BIU-87/ADM細(xì)胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。

關(guān)鍵詞：苦參堿；BIU-87/ADM細(xì)胞；多藥耐藥；逆轉(zhuǎn)

腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥（multidrug resistance, MDR）是導(dǎo)致腫瘤化療失敗主要原因之一。目前研究表明，細(xì)胞膜上P-糖蛋白（P-gp）的過度表達(dá)及P-gp ATP酶活性升高是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MDR的主要機(jī)制[1-2]?？鄥A作為苦參的主要活性成分，具有明顯的化療增敏作用，目前已廣泛用于腫瘤的輔助治療[3-6]，但對(duì)人膀胱癌阿霉素（ADM）耐藥是否具有逆轉(zhuǎn)作用，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬探討苦參堿對(duì)人膀胱癌BIU-87/ADM耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞

人膀胱癌BIU-87細(xì)胞及BIU-87/ADM耐藥細(xì)胞由四川大學(xué)華西醫(yī)院泌尿外科贈(zèng)送，蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科研究所保藏。

1.2主要試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)基（北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司），胎牛血清、MTT（美國Sigma公司），RIPA裂解液、Bradford蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），P-gp抗體、β-actin抗體（美國SantaCruz公司），HRP偶聯(lián)羊抗鼠二抗（北京中杉金橋公司），P-gp-GloTMAssay System試劑檢測盒（美國Promega公司）；CO2培養(yǎng)箱、全波長Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀（美國Thermo公司），熒光光度計(jì)（RF-5301PC，日本島津）。

1.3藥物

苦參堿注射液，山西振東泰盛制藥有限公司，批號(hào)130120；注射用鹽酸多柔比星，山西普德藥業(yè)有限公司，批號(hào)1211-1。

1.4細(xì)胞存活率檢測

取對(duì)數(shù)生長期人膀胱癌BIU-87細(xì)胞及BIU-87/ ADM耐藥細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后加不同濃度苦參堿（0.5、1.0、2.0 μg/mL）和10 μg/mL ADM，對(duì)照組在培養(yǎng)體系中加同濃度DMSO。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)基，各孔加5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h。棄培養(yǎng)基，每孔加DMSO 200 μL，待溶解顯色后于酶標(biāo)儀570 nm波長處測定OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率（實(shí)驗(yàn)組平均OD值÷對(duì)照組平均OD值×100%）。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5阿霉素蓄積檢測

參考文獻(xiàn)[2，7]方法，通過檢測ADM自發(fā)熒光強(qiáng)度反映ADM的蓄積程度。收集1×106BIU-87/ADM細(xì)胞，與不同濃度苦參堿或DMSO于37 ℃孵育1 h 加10 μg/mL ADM孵育3 h。冷PBS洗滌細(xì)胞3次后，重懸收集細(xì)胞，熒光光度計(jì)檢測分析相同數(shù)目細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長480 nm，發(fā)射波長570 nm，并計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度值。

1.6阿霉素外排檢測

加含10 μg/mL ADM的培養(yǎng)液與細(xì)胞孵育3 h后，棄培養(yǎng)基。加不同濃度苦參堿或DMSO培養(yǎng)液后，繼續(xù)孵育1 h。冷PBS洗滌3次后，重懸收集細(xì)胞，熒光光度計(jì)檢測。

1.7Western blot檢測

按“1.4”項(xiàng)處理細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌加蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白。Bradford法蛋白定量，上樣量30 μg，10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳2.5 h。PVDF膜轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（1∶1000稀釋）4 ℃孵育過夜；1×TBST洗滌3×10 min。二抗（1∶2000稀釋）37 ℃孵育2 h，1×TBST洗滌3×10 min。ECL顯色法進(jìn)行檢測。采用軟件Image pro plus 6.0比較條帶的積分光密度。

1.8P-糖蛋白ATP酶檢測

嚴(yán)格按P-gp-GloTMAssay System試劑盒使用說明書進(jìn)行檢測。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析，組間均數(shù)多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1苦參堿逆轉(zhuǎn)BIU-87/ADM細(xì)胞對(duì)阿霉素耐藥性的影響

經(jīng)ADM作用后，與敏感細(xì)胞株BIU-87存活率比較，耐藥細(xì)胞株BIU-87/ADM存活率明顯增加（P＜0.001），即BIU-87/ADM細(xì)胞對(duì)ADM表現(xiàn)出明顯的耐藥性。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，苦參堿單獨(dú)作用于BIU-87/ADM細(xì)胞的IC50為32.5 μg/mL，本實(shí)驗(yàn)選取對(duì)BIU-87/ADM細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒作用的劑量0.5，1.0、2.0 μg/mL。結(jié)果顯示，苦參堿呈劑量依賴地降低BIU-87/ADM細(xì)胞存活率，即有效地逆轉(zhuǎn)BIU-87/ADM細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥性，而對(duì)敏感細(xì)胞株BIU-87細(xì)胞存活率無顯著影響，見表1。

表1　各組細(xì)胞存活率比較（±s，%）

表1　各組細(xì)胞存活率比較（±s，%）

注：與同組BIU-87比較，###P＜0.001；與ADM組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001（下同）

組別　n　BIU-87　BIU-87/ADM對(duì)照組　3　100　100 ADM組　3　42.7±10.1　87.1±13.3###ADM＋苦參堿0.5 μg/mL組　3　42.6± 9.2　70.6±13.4*ADM＋苦參堿1.0 μg/mL組　3　42.5± 8.9　65.7± 9.7**ADM＋苦參堿2.0 μg/mL組　3　43.1±11.4　57.5±12.7***

2.2苦參堿對(duì)阿霉素BIU-87/ADM細(xì)胞內(nèi)蓄積的影響

預(yù)先未加苦參堿，單純ADM作用后，BIU-87/ ADM細(xì)胞內(nèi)ADM的熒光強(qiáng)度較弱，即ADM蓄積水平較低?？鄥A呈劑量依賴地增加ADM在BIU-87/ADM細(xì)胞中蓄積水平，見表2。

表2　各組BIU-87/ADM細(xì)胞ADM蓄積水平比較（±s）

表2　各組BIU-87/ADM細(xì)胞ADM蓄積水平比較（±s）

組別　n　相對(duì)熒光強(qiáng)度值A(chǔ)DM組　3　　1.00±0.00 ADM＋苦參堿0.5 μg/mL組　3　　1.61±0.21*ADM＋苦參堿1.0 μg/mL組　3　　1.95±0.52**ADM＋苦參堿2.0 μg/mL組　3　　2.27±0.38***

2.3苦參堿對(duì)阿霉素BIU-87/ADM細(xì)胞內(nèi)外排的影響

經(jīng)ADM孵育BIU-87/ADM細(xì)胞3 h后，再加不同濃度苦參堿或DMSO。結(jié)果顯示，溶劑組BIU-87/ADM細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度較低，即ADM外排較多；苦參堿明顯增加細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，即抑制ADM的外排，見表3。

表3　各組BIU-87/ADM細(xì)胞ADM外排水平比較（±s）

表3　各組BIU-87/ADM細(xì)胞ADM外排水平比較（±s）

組別　n　相對(duì)熒光強(qiáng)度值A(chǔ)DM組　3　　1.00±0.00 ADM＋苦參堿0.5 μg/mL組　3　　1.24±0.32 ADM＋苦參堿1.0 μg/mL組　3　　1.53±0.22*ADM＋苦參堿2.0 μg/mL組　3　　1.63±0.51**

2.4苦參堿對(duì)BIU-87/ADM細(xì)胞P-糖蛋白表達(dá)及其ATP酶活性的影響

苦參堿明顯抑制BIU-87/ADM細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)（見圖1），并呈劑量依賴地抑制P-gp ATP酶活性，見表4。

圖1　各組BIU-87/ADM細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)

表4　各組BIU-87/ADM細(xì)胞P-gp ATP酶活性比較（±s）

表4　各組BIU-87/ADM細(xì)胞P-gp ATP酶活性比較（±s）

3　討論

人膀胱癌BIU-87/ADM耐藥細(xì)胞模型是研究膀胱癌多藥耐藥的最常用模型之一[8]。本研究通過建立該模型評(píng)價(jià)苦參堿對(duì)BIU-87/ADM耐藥的逆轉(zhuǎn)作用，結(jié)果顯示，苦參堿可劑量依賴地逆轉(zhuǎn)BIU-87/ADM細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥性。

P-gp具有ATP依賴性“藥泵”功能，通過與ATP結(jié)合將細(xì)胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外，減少藥物蓄積，降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，從而導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，苦參堿能顯著抑制ADM外排，增加ADM在BIU-87/ADM細(xì)胞中蓄積水平，這提示苦參堿對(duì)BIU-87/ADM耐藥的逆轉(zhuǎn)作用可能與調(diào)節(jié)P-gp蛋白表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苦參堿呈劑量依賴地抑制P-gp蛋白表達(dá)，驗(yàn)證了上述推斷，即苦參堿通過抑制P-gp蛋白表達(dá)，減少ADM外排，增加ADM在BIU-87/ADM細(xì)胞中蓄積水平，從而發(fā)揮其對(duì)BIU-87/ADM耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。

一般認(rèn)為，P-gp藥物外排作用與ATP的水解相偶聯(lián)，所以P-gp底物可誘導(dǎo)ATP酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)，在BIU-87/ADM耐藥細(xì)胞株中ADM能明顯增加P-gp ATP酶活性，即ADM為P-gp底物，這與前人報(bào)道一致[9]。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)苦參堿能抑制BIU-87/ADM耐藥細(xì)胞株中P-gp ATP酶活性。

綜上，苦參堿對(duì)BIU-87/ADM細(xì)胞耐ADM具有較強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)作用，其機(jī)制是通過抑制P-gp蛋白表達(dá)，降低P-gp ATP酶活性，減少P-gp外排作用，從而增加ADM在細(xì)胞內(nèi)的蓄積。

[1] GILLET J P, GOTTESMAN M M. Mechanisms of multidrug resistance in cancer[M]. New Jersey：Humana Press,2010：47-76.

[2] MICHAELIS M, ROTHWEILER F, KLASSERT D, et al. Reversal of P-glycoprotein–mediated multidrug resistance by the murine double minute 2 antagonist nutlin-3[J]. Cancer research,2009, 69(2)：416-421.

[3] 曹晟丞,張海盛,柳江英.復(fù)方苦參注射液對(duì)卵巢癌化療患者免疫功能及生存質(zhì)量的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2015,22(8)：35-37.

[4] 王磊,李靈招,王曉芳,等.復(fù)方苦參注射液聯(lián)合伽瑪?shù)吨委熅植客砥谝认侔┡R床研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2015,22(6)：21-24.

[5] 魏有剛.復(fù)方苦參注射液聯(lián)合鹽酸羥考酮治療肺癌疼痛療效觀察[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2015,22(10)：28-30.

[6] 曹亮,郭彥偉,王志偉,等.復(fù)方苦參注射液防治肝動(dòng)脈栓塞化療術(shù)對(duì)中晚期肝癌患者肝損害臨床觀察[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2014,21(6)：98-99.

[7] TANG X, GU X, REN Z, et al. Synthesis and evaluation of substituted dibenzo[c,e]azepine-5-ones as P-glycoproteinmediated multidrug resistance reversal agents[J]. Bioorg Med Chem Lett,2012,2(8)：2675-2680.

[8] 林勁權(quán),周輝良,蔡衛(wèi)平.mdrl shRNA逆轉(zhuǎn)膀胱癌耐藥細(xì)胞株BIU-87/ ADM對(duì)ADM的耐藥性[J].現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志,2013,5(6)：356-359. [9] 王磊,柯紅,王一羽,等.姜黃素逆轉(zhuǎn)P糖蛋白介導(dǎo)的膀胱腫瘤多藥耐藥的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2009,20(3)：101-103.

（修回日期：2015-05-30；編輯：華強(qiáng)）

Effects of Matrine on Multidrug Resistance of Human Bladder Cancer BIU-87/ADM Cells

ZUO Ling-jun, ZHANG Yun-xin, DUAN Jian-min (Department of Urology Surgery, The Second Hospital Affiliated to Lanzhou University, Lanzhou 730030, China)

Abstract:Objective To investigate the reversal mechanism of matrine on multidrug resistance (MDR) in BIU-87/ADM cells. Methods The cell proliferation inhibition rate was detected by MTT assay; the accumulation and efflux of ADM was detected by fluorescence spectrophotometer; the expression of P-gp protein was tested by Western blot; the activity of P-gp ATPase was measured by P-gp-GloTMAssay System kit. Results Compared with the sensitive cell line BIU-87, the survival rate of multidrug resistant cell line BIU-87/ADM was significantly increased after treated with ADM (P<0.001); matrine reduced the survival rate of BIU-87/ADM cells with a manner of dose-dependently (P<0.01), without significant effect on the BIU-87 cell. Matrine increased accumulation of ADM and inhibited P-gp-mediated efflux of ADM. Matrine decreased the expression of P-gp and inhibited the activity of P-gp ATPase significantly. Conclusion Matrine can reverse multidrug resistance in BIU-87/ADM cells by inhibiting the expression of P-gp and ATPase activity, reducing P-gp-mediated efflux of ADM, and increasing accumulation of ADM to play the role in reversal effects on multidrug resistance of human bladder cancer BIU-87/ADM cells.

Key words:matrine; BIU-87/ADM cells; multidrug resistance; reversal

收稿日期：（2015-04-21）

基金項(xiàng)目：甘肅省自然科學(xué)研究基金計(jì)劃（145RJYA256）

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-5304(2016)02-0073-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.020