熊輝，石金敏，周燦，鄒青偉，張曉燕湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000

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正交試驗(yàn)優(yōu)選二花青葉抗敏洗劑提取工藝

熊輝，石金敏，周燦，鄒青偉，張曉燕
湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000

摘要：目的優(yōu)選二花青葉抗敏洗劑提取工藝條件。方法采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以綠原酸、芍藥苷含量和干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳提取工藝，采用高效液相色譜法測(cè)定綠原酸、咖啡酸和芍藥苷的含量。結(jié)果正交試驗(yàn)所得最佳提取條件為加8倍量水，提取3次，每次1 h。結(jié)論該提取工藝合理、可行，可用于二花青葉抗敏洗劑中藥材的提取。

關(guān)鍵詞：提取工藝；正交試驗(yàn)；綠原酸；咖啡酸；芍藥苷

二花青葉抗敏洗劑為本院院內(nèi)制劑，由金銀花、蒲公英、野菊花、赤芍、大青葉等8味藥組成，具有清熱利濕、涼血解毒、祛風(fēng)止癢功效，臨床用于治療過敏性皮炎。研究表明，金銀花[1-2]、蒲公英[3]、野菊花[4]、大青葉等水提物均具有抗過敏作用。因此，本研究采用正交試驗(yàn)法，以綠原酸、芍藥苷、咖啡酸和干膏得率作為考察指標(biāo)，對(duì)水提工藝的加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行優(yōu)選，以確定最佳水提工藝，為該制劑擴(kuò)大生產(chǎn)提供依據(jù)。

1　儀器與試藥

日本島津高效液相色譜儀，包括LC-20AD泵，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-M20A紫外檢測(cè)器；萬(wàn)分之一電子分析天平（FA2004，上海天平儀器廠）；恒溫干燥箱（KWY-101型，武漢市武昌實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

金銀花、蒲公英、野菊花、赤芍、大青葉等中藥飲片均購(gòu)自亳州市宏宇中藥飲片有限公司，符合2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）規(guī)定；對(duì)照品綠原酸（批號(hào)110753-201415）、咖啡酸（批號(hào)110885-200102）、芍藥苷（批號(hào)110736-201438），中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2　方法和結(jié)果

2.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)為影響因素，每因素選取3個(gè)水平，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1　正交試驗(yàn)因素水平表

2.2樣品的制備

按處方量（515 g原藥材）稱取金銀花、赤芍等藥材各9份，分別按相應(yīng)倍數(shù)加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行提取，各組藥液分別用紗布過濾后，最后定容至250 mL，備用。

2.3干膏得率測(cè)定

精密吸取藥材水煎液20 mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，移至烘箱中，105 ℃干燥3 h，移至干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏得率。

2.4綠原酸、咖啡酸、芍藥苷含量測(cè)定

2.4.1色譜條件色譜柱：Inertsil C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.02%磷酸水溶液（11∶89）；流速1.0 mL/min；綠原酸和咖啡酸檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm，芍藥苷檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；柱溫40 ℃。理論塔板數(shù)按綠原酸、咖啡酸、芍藥苷峰計(jì)算均不低于3000[5]。

2.4.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取綠原酸、咖啡酸、芍藥苷對(duì)照品適量，分別加水制成每1 mL含30、5、56 μg對(duì)照品的溶液，即得綠原酸、咖啡酸、芍藥苷對(duì)照品溶液。

2.4.3供試品溶液的制備精密吸取定容至250 mL的水煎液1 mL，定容至10 mL容量瓶，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4線性關(guān)系考察取綠原酸、咖啡酸、芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，加水溶解并添加至刻度，搖勻，用水逐級(jí)稀釋，分別得綠原酸對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為120、60、30、15、7.5、3.75、1.875 μg/mL，咖啡酸對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為80、40、20、10、5、2.5、1.25 μg/mL，芍藥苷對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為450、225、112.5、56.25、28.12、14.06、7.03 μg/mL。精密吸取上述不同濃度的對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。綠原酸Y＝1.8×107X－19 702，r＝0.999 9；咖啡酸Y＝3.8×107X－6482.2，r＝0.999 9；芍藥苷Y＝1.1× 107X－10 013，r＝1.000 0。結(jié)果表明，綠原酸、咖啡酸、芍藥苷進(jìn)樣量分別在1.875～120 μg、1.25～80 μg、7.03～450 μg之間與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.5精密度試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算綠原酸、咖啡酸、芍藥苷峰面積RSD分別為0.28%、0.93%、0.67%，表明儀器精密度良好。

2.4.6重復(fù)性試驗(yàn)取同一水煎液，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，測(cè)定峰面積，計(jì)算綠原酸、咖啡酸、芍藥苷含量，RSD分別為0.71%、0.57%、1.4%，表明樣品制備方法重復(fù)性良好。

2.4.7穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD分別為0.71%、1.79%、1.02%，表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性較好。

2.4.8加樣回收率試驗(yàn)精密吸取同一水煎液6份，精密加入適量綠原酸、咖啡酸、芍藥苷，同法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定綠原酸、咖啡酸、芍藥苷的含量，計(jì)算得綠原酸、咖啡酸、芍藥苷平均加樣回收率分別為100.31%、98.82%、100.25%，RSD分別為0.42%、1.72%、2.39%，表明方法回收率良好。

2.4.9樣品測(cè)定分別取上述各樣品溶液10 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

2.5正交試驗(yàn)

以綠原酸、咖啡酸、芍藥苷含量及干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)水提取工藝的影響。正交試驗(yàn)安排與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2　正交試驗(yàn)安排與結(jié)果

表3　正交試驗(yàn)方差分析

從方差分析結(jié)果可知，煎煮次數(shù)為影響水提工藝的重要因素，其次為加水量，煎煮時(shí)間影響不大。由直觀分析可知，綠原酸最優(yōu)工藝為A2B2C3，咖啡酸最優(yōu)工藝為A3B3C3，芍藥苷最優(yōu)工藝為A3B3C3，干膏得率最優(yōu)工藝為A3B3C3。煎煮時(shí)間對(duì)4個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)均無(wú)明顯影響，因此，確定最優(yōu)煎煮時(shí)間為1 h；考察加水量時(shí)，4個(gè)考察指標(biāo)中只有干膏得率的P＜0.10，因此最終選擇加水量的最優(yōu)條件為8倍量水；提取次數(shù)對(duì)4個(gè)考察指標(biāo)存在明顯影響，因此，提取次數(shù)確定最優(yōu)條件為提取3次。綜合上述結(jié)果，最終確定最佳工藝為：加8倍量水，提取3次，提取時(shí)間均為1 h[6]。

2.6驗(yàn)證試驗(yàn)

按最佳提取工藝制備3批樣品，測(cè)定樣品中綠原酸、咖啡酸、芍藥苷含量和干膏得率，結(jié)果見表4。說明該工藝穩(wěn)定可行。

表4　工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（%）

3　討論

由于組方中藥飲片水提物具有明顯的抗過敏作用，故采用傳統(tǒng)的水提法，以君藥（金銀花、蒲公英）和臣藥（赤芍）的活性成分綠原酸、咖啡酸和芍藥苷為檢測(cè)指標(biāo)優(yōu)化水提工藝，而干膏得率是藥物治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，故也應(yīng)作為檢測(cè)指標(biāo)。

含量測(cè)定流動(dòng)相的選擇曾經(jīng)嘗試乙腈-水（11∶89）、乙腈-0.02%磷酸水（11∶89）、甲醇-0.02%磷酸水（20∶80），發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為乙腈-0.02%磷酸水（11∶89）時(shí)，目標(biāo)色譜峰的分離度、峰形較好，故選擇該比例為流動(dòng)相。

本研究所確定的工藝合理、穩(wěn)定，可作為二花青葉抗敏洗劑的提取工藝進(jìn)行生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

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（修回日期：2015-04-24；編輯：陳靜）

·經(jīng)驗(yàn)交流·

Optimization of Extraction Technology for Erhuaqingye Kangmin Lotion by Orthogonal Text

XIONG Hui, SHI Jin-min, ZHOU Can, ZOU Qing-wei, ZHANG Xiao-yan (Department of Pharmacy of Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China)

Abstract:Objective To optimize extraction technology of Erhuaqingye Kangmin Lotion. Methods L9(34) orthogonal test was used; Yield of extract, and the contents of chlorogenic acid and paeoniflorin were set as evaluation indexes to screen the optimum extraction technology. The contents of chlorogenic acid, caffeic acid and paeoniflorin were determined by HPLC. Results Optimum extraction technology was as follows: extracting 3 times with 8 times of water for 1 h each time. Conclusion The optimum technology is reasonable and feasible, which can be used for the extraction of Erhuaqingye Kangmin Lotion.

Key words:extraction technology; orthogonal test; chlorogenic acid; caffeic acid; paeoniflorin

收稿日期：（2015-04-14）

通訊作者：張曉燕，E-mail：coarff66@126.com

基金項(xiàng)目：湖北省高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升計(jì)劃（2012年）

中圖分類號(hào)：R283.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-5304(2016)02-0103-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.029