熊輝，石金敏，周燦，鄒青偉，張曉燕湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000

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正交試驗優(yōu)選二花青葉抗敏洗劑提取工藝

熊輝，石金敏，周燦，鄒青偉，張曉燕
湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000

摘要：目的優(yōu)選二花青葉抗敏洗劑提取工藝條件。方法采用L9（34）正交試驗設計，以綠原酸、芍藥苷含量和干膏得率為評價指標，篩選最佳提取工藝，采用高效液相色譜法測定綠原酸、咖啡酸和芍藥苷的含量。結(jié)果正交試驗所得最佳提取條件為加8倍量水，提取3次，每次1 h。結(jié)論該提取工藝合理、可行，可用于二花青葉抗敏洗劑中藥材的提取。

關鍵詞：提取工藝；正交試驗；綠原酸；咖啡酸；芍藥苷

二花青葉抗敏洗劑為本院院內(nèi)制劑，由金銀花、蒲公英、野菊花、赤芍、大青葉等8味藥組成，具有清熱利濕、涼血解毒、祛風止癢功效，臨床用于治療過敏性皮炎。研究表明，金銀花[1-2]、蒲公英[3]、野菊花[4]、大青葉等水提物均具有抗過敏作用。因此，本研究采用正交試驗法，以綠原酸、芍藥苷、咖啡酸和干膏得率作為考察指標，對水提工藝的加水量、提取時間和提取次數(shù)進行優(yōu)選，以確定最佳水提工藝，為該制劑擴大生產(chǎn)提供依據(jù)。

1　儀器與試藥

日本島津高效液相色譜儀，包括LC-20AD泵，SIL-20A自動進樣器，SPD-M20A紫外檢測器；萬分之一電子分析天平（FA2004，上海天平儀器廠）；恒溫干燥箱（KWY-101型，武漢市武昌實驗儀器廠）。

金銀花、蒲公英、野菊花、赤芍、大青葉等中藥飲片均購自亳州市宏宇中藥飲片有限公司，符合2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）規(guī)定；對照品綠原酸（批號110753-201415）、咖啡酸（批號110885-200102）、芍藥苷（批號110736-201438），中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2　方法和結(jié)果

2.1正交試驗設計

在預試驗基礎上，確定加水量、提取時間和提取次數(shù)為影響因素，每因素選取3個水平，正交試驗因素水平見表1。

表1　正交試驗因素水平表

2.2樣品的制備

按處方量（515 g原藥材）稱取金銀花、赤芍等藥材各9份，分別按相應倍數(shù)加水量、提取時間和提取次數(shù)進行提取，各組藥液分別用紗布過濾后，最后定容至250 mL，備用。

2.3干膏得率測定

精密吸取藥材水煎液20 mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，移至烘箱中，105 ℃干燥3 h，移至干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計算干膏得率。

2.4綠原酸、咖啡酸、芍藥苷含量測定

2.4.1色譜條件色譜柱：Inertsil C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.02%磷酸水溶液（11∶89）；流速1.0 mL/min；綠原酸和咖啡酸檢測波長323 nm，芍藥苷檢測波長230 nm；柱溫40 ℃。理論塔板數(shù)按綠原酸、咖啡酸、芍藥苷峰計算均不低于3000[5]。

2.4.2對照品溶液的制備精密稱取綠原酸、咖啡酸、芍藥苷對照品適量，分別加水制成每1 mL含30、5、56 μg對照品的溶液，即得綠原酸、咖啡酸、芍藥苷對照品溶液。

2.4.3供試品溶液的制備精密吸取定容至250 mL的水煎液1 mL，定容至10 mL容量瓶，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4線性關系考察取綠原酸、咖啡酸、芍藥苷對照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，加水溶解并添加至刻度，搖勻，用水逐級稀釋，分別得綠原酸對照品溶液質(zhì)量濃度為120、60、30、15、7.5、3.75、1.875 μg/mL，咖啡酸對照品溶液質(zhì)量濃度為80、40、20、10、5、2.5、1.25 μg/mL，芍藥苷對照品溶液質(zhì)量濃度為450、225、112.5、56.25、28.12、14.06、7.03 μg/mL。精密吸取上述不同濃度的對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。以進樣質(zhì)量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。綠原酸Y＝1.8×107X－19 702，r＝0.999 9；咖啡酸Y＝3.8×107X－6482.2，r＝0.999 9；芍藥苷Y＝1.1× 107X－10 013，r＝1.000 0。結(jié)果表明，綠原酸、咖啡酸、芍藥苷進樣量分別在1.875～120 μg、1.25～80 μg、7.03～450 μg之間與峰面積線性關系良好。

2.4.5精密度試驗精密吸取同一供試品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，計算綠原酸、咖啡酸、芍藥苷峰面積RSD分別為0.28%、0.93%、0.67%，表明儀器精密度良好。

2.4.6重復性試驗取同一水煎液，按“2.4.3”項下方法制備6份供試品溶液，測定峰面積，計算綠原酸、咖啡酸、芍藥苷含量，RSD分別為0.71%、0.57%、1.4%，表明樣品制備方法重復性良好。

2.4.7穩(wěn)定性試驗精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進樣10 μL，測定峰面積，計算RSD分別為0.71%、1.79%、1.02%，表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性較好。

2.4.8加樣回收率試驗精密吸取同一水煎液6份，精密加入適量綠原酸、咖啡酸、芍藥苷，同法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件分別進樣分析，進樣量10 μL，測定綠原酸、咖啡酸、芍藥苷的含量，計算得綠原酸、咖啡酸、芍藥苷平均加樣回收率分別為100.31%、98.82%、100.25%，RSD分別為0.42%、1.72%、2.39%，表明方法回收率良好。

2.4.9樣品測定分別取上述各樣品溶液10 μL，按“2.4.1”項下色譜條件進行測定。

2.5正交試驗

以綠原酸、咖啡酸、芍藥苷含量及干膏得率為評價指標，考察加水量、提取時間和提取次數(shù)對水提取工藝的影響。正交試驗安排與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2　正交試驗安排與結(jié)果

表3　正交試驗方差分析

從方差分析結(jié)果可知，煎煮次數(shù)為影響水提工藝的重要因素，其次為加水量，煎煮時間影響不大。由直觀分析可知，綠原酸最優(yōu)工藝為A2B2C3，咖啡酸最優(yōu)工藝為A3B3C3，芍藥苷最優(yōu)工藝為A3B3C3，干膏得率最優(yōu)工藝為A3B3C3。煎煮時間對4個評價指標均無明顯影響，因此，確定最優(yōu)煎煮時間為1 h；考察加水量時，4個考察指標中只有干膏得率的P＜0.10，因此最終選擇加水量的最優(yōu)條件為8倍量水；提取次數(shù)對4個考察指標存在明顯影響，因此，提取次數(shù)確定最優(yōu)條件為提取3次。綜合上述結(jié)果，最終確定最佳工藝為：加8倍量水，提取3次，提取時間均為1 h[6]。

2.6驗證試驗

按最佳提取工藝制備3批樣品，測定樣品中綠原酸、咖啡酸、芍藥苷含量和干膏得率，結(jié)果見表4。說明該工藝穩(wěn)定可行。

表4　工藝驗證試驗結(jié)果（%）

3　討論

由于組方中藥飲片水提物具有明顯的抗過敏作用，故采用傳統(tǒng)的水提法，以君藥（金銀花、蒲公英）和臣藥（赤芍）的活性成分綠原酸、咖啡酸和芍藥苷為檢測指標優(yōu)化水提工藝，而干膏得率是藥物治療疾病的物質(zhì)基礎，故也應作為檢測指標。

含量測定流動相的選擇曾經(jīng)嘗試乙腈-水（11∶89）、乙腈-0.02%磷酸水（11∶89）、甲醇-0.02%磷酸水（20∶80），發(fā)現(xiàn)流動相為乙腈-0.02%磷酸水（11∶89）時，目標色譜峰的分離度、峰形較好，故選擇該比例為流動相。

本研究所確定的工藝合理、穩(wěn)定，可作為二花青葉抗敏洗劑的提取工藝進行生產(chǎn)。

參考文獻：

[1] 賀玉琢.金銀花抗促過敏作用(2)[J].國際中醫(yī)中藥雜志,2006,28(6)：363.

[2] 李揚,董銀卯,孟宏,等.7種中草藥提取物抗過敏功效及刺激性研究[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(4)：191-194.

[3] 林云,江林,蔣健,等.蒲公英的藥理作用研究進展[J].中國現(xiàn)代中藥, 2011,13(8)：42-47.

[4] 鄭璐璐,張貴君,王晶娟,等.野菊花藥效組分抗炎的生物效應研究[J].天津中醫(yī)藥,2011,28(3)：251-253.

[5] 張潔,曹旭,朱迪,等.蒲薏顆粒提取工藝優(yōu)選[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2014,45(11)：1031-1065.

[6] 劉麗俠,申林卉,陶遵威.正交試驗法優(yōu)選降糖通絡顆粒提取工藝[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2014,21(3)：81-83.

（修回日期：2015-04-24；編輯：陳靜）

·經(jīng)驗交流·

Optimization of Extraction Technology for Erhuaqingye Kangmin Lotion by Orthogonal Text

XIONG Hui, SHI Jin-min, ZHOU Can, ZOU Qing-wei, ZHANG Xiao-yan (Department of Pharmacy of Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China)

Abstract:Objective To optimize extraction technology of Erhuaqingye Kangmin Lotion. Methods L9(34) orthogonal test was used; Yield of extract, and the contents of chlorogenic acid and paeoniflorin were set as evaluation indexes to screen the optimum extraction technology. The contents of chlorogenic acid, caffeic acid and paeoniflorin were determined by HPLC. Results Optimum extraction technology was as follows: extracting 3 times with 8 times of water for 1 h each time. Conclusion The optimum technology is reasonable and feasible, which can be used for the extraction of Erhuaqingye Kangmin Lotion.

Key words:extraction technology; orthogonal test; chlorogenic acid; caffeic acid; paeoniflorin

收稿日期：（2015-04-14）

通訊作者：張曉燕，E-mail：coarff66@126.com

基金項目：湖北省高等學校創(chuàng)新能力提升計劃（2012年）

中圖分類號：R283.5

文獻標識碼：A

文章編號：1005-5304(2016)02-0103-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.029