張　志，羅保斌，劉東艷，董明綱

(1.河北醫(yī)科大學(xué)附屬石家莊市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050021；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100700；3.河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)編輯部，河北 張家口 075000)

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結(jié)核分枝桿菌基因分型技術(shù)研究進(jìn)展

張志1，羅保斌2，劉東艷2，董明綱3

(1.河北醫(yī)科大學(xué)附屬石家莊市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050021；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100700；3.河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)編輯部，河北 張家口 075000)

結(jié)核分枝桿菌；基因分型；插入序列6110限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)；數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列技術(shù)；間隔區(qū)寡核苷酸分型技術(shù)；單核苷酸多態(tài)性分析技術(shù)；長(zhǎng)片段多態(tài)性分析技術(shù)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterialtuberculosis,MTB)是結(jié)核病的病原體，可累及全身多種組織器官，以肺組織受累最常見。近幾年由于流動(dòng)人口的增加和HIV病毒感染的流行，結(jié)核病再次成為嚴(yán)重危害世界公共衛(wèi)生的傳染病之一。結(jié)核病再度肆虐,其主要原因之一就是結(jié)核分支桿菌的變異。因此從分子水平研究結(jié)核分枝桿菌的基因特征并進(jìn)行分型鑒定,明確主要流行菌型，以更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)和判斷結(jié)核病的暴發(fā)流行及傳播方式，對(duì)有效防治結(jié)核病具有重大意義?，F(xiàn)就常用的MTB基因分型技術(shù)作一綜述。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，結(jié)核分枝桿菌的基因分型技術(shù)發(fā)展迅速，目前常用的技術(shù)包括插入序列6110限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)(IS6110-RFLP)、數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列技術(shù)(variable number tandem repeats，VNTR)、間隔區(qū)寡核苷酸分型技術(shù)(spoligotyping)、單核苷酸多態(tài)性分析技術(shù)(single nucleotide polymorphism,SNP)和長(zhǎng)片段多態(tài)性分析技術(shù)(large sequence polymorphism,LSP)等。

1　插入序列6110限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)(IS6110-RFLP)

IS6110是結(jié)核分枝桿菌特有的、隨機(jī)插入染色體內(nèi)的重復(fù)序列。IS6110-RFLP是用IS6110作為探針進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析的一種DNA指紋圖譜技術(shù)，是第一個(gè)廣泛應(yīng)用的MTB基因分型技術(shù)。該技術(shù)是從結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基中刮取菌株，提取純化DNA，用限制性內(nèi)切酶在特定位點(diǎn)切割DNA獲得不同長(zhǎng)度的DNA片段，將其在瓊脂糖凝膠上電泳分離，Southern免疫轉(zhuǎn)印，用標(biāo)記的DNA IS6110序列中的某片段作為探針，進(jìn)行雜交，經(jīng)放射自顯影，即獲得限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性圖譜[1]。無(wú)流行病學(xué)聯(lián)系的患者體內(nèi)分離的MTB菌株呈現(xiàn)出不同的RFLP圖譜，而近期傳播的患者體內(nèi)分離的MTB菌株呈現(xiàn)出相同的指紋圖譜，因此可追蹤MTB在人群中的傳播情況。該技術(shù)對(duì)IS6110拷貝數(shù)大于6的菌株分辨率較高，對(duì)IS6110拷貝數(shù)少或無(wú)IS6110的菌株難以進(jìn)行分型鑒定，需要輔以其他分型方法。IS6110-RFLP分型技術(shù)需要培養(yǎng)3～6周才能獲得足夠的DNA量，操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，同時(shí)圖譜識(shí)讀需要軟件支持，在一般實(shí)驗(yàn)室難以推廣，因此目前該技術(shù)一般作為補(bǔ)充和參考標(biāo)準(zhǔn)使用[2]。

2　數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)分型技術(shù)

MTB染色體中存在很多結(jié)核分枝桿菌散在重復(fù)單位(MIRU)，每一位點(diǎn)包括多個(gè)首尾相連的完全相同或有輕微差異的重復(fù)序列，即數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)。VNTR分型法是以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)，建立在數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列上的基因分型技術(shù)，也稱MIRU-VNTR技術(shù)[3]。以VNTR位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)DNA ladder同時(shí)進(jìn)行電泳分離，根據(jù)電泳圖譜判讀每一位點(diǎn)的拷貝數(shù)，從而為每一菌株建立數(shù)字化的數(shù)據(jù)庫(kù)。目前，實(shí)驗(yàn)室常用的有15位點(diǎn)和24位點(diǎn)兩種分型法，其中15位點(diǎn)可用于分子流行病學(xué)研究，24位點(diǎn)可用于系統(tǒng)發(fā)育學(xué)(菌株遺傳結(jié)構(gòu))研究[4-5]。VNTR分型技術(shù)的分辨率接近IS6110-RFLP，對(duì)IS6110拷貝數(shù)少的菌株也有很好的分型能力[6]。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、成本低廉、重復(fù)性好、數(shù)字化的結(jié)果很容易在計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)分類，便于不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果比較，可用于結(jié)核病流行病學(xué)研究，監(jiān)測(cè)耐藥MTB菌株傳播情況。然而，在中國(guó)結(jié)核病流行廣泛，傳播力較強(qiáng)，北京型菌株高發(fā)，所獲得的MTB菌株數(shù)量大，基因同質(zhì)化比率高，采用15位點(diǎn)VNTR分型法不能完全區(qū)分菌株，雖然24位點(diǎn)VNTR分型法的分辨率可以接受，但不利于推廣，因此VNTR基因分型技術(shù)的位點(diǎn)選擇具有很強(qiáng)的地域性[7]，需要不斷完善，尋找適合本國(guó)家、本地區(qū)的多態(tài)性位點(diǎn)，或與其他分型技術(shù)相結(jié)合，提高分辨率。

3　間隔區(qū)寡核苷酸分型技術(shù)(spolig-otyping)

在MTB染色體中，有一個(gè)直接重復(fù)(direct repeat,DR)區(qū)，包含10～50個(gè)拷貝的由36個(gè)堿基(base pair,bp)組成的直接重復(fù)序列和35～41bp的非重復(fù)間隔序列。不同菌株之間的間隔區(qū)序列具有保守性。Spoligotyping分型法是利用43個(gè)特定間隔區(qū)的缺失或存在進(jìn)行多態(tài)性分析的分型技術(shù)。北京型菌株具有相同的特征性間隔序列，表現(xiàn)為僅與35～43之間的9個(gè)間隔區(qū)雜交呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，因而該技術(shù)被公認(rèn)為北京家族菌株鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)[8]。該技術(shù)只需少量DNA，操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)字化，易于實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果比較，能對(duì)IS6110低拷貝菌株進(jìn)行分型，但分辨率不及IS6110-RFLP分型法，不能識(shí)別復(fù)合感染，故僅適用于MTB初篩或基因群的分型[9]。目前常將spoligotying與VNTR相結(jié)合，用于MTB基因分型[10-11]。

4　單核苷酸多態(tài)性分析技術(shù)(SNP)和長(zhǎng)片段多態(tài)性分析技術(shù)(LSP)

單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性。長(zhǎng)片段多態(tài)性(LSP)的產(chǎn)生可能是由于基因組大片段的基因缺失或重排導(dǎo)致的[12]。隨著全基因組測(cè)序分析的快速發(fā)展，各種有代表性的結(jié)核菌株測(cè)序完成，MTB基因組間比對(duì)成為可能。研究發(fā)現(xiàn)菌株的LSP和SNP具有較高的遺傳穩(wěn)定性，SNP能夠鑒定出全球流行的MTB六大譜系，并能夠通過SNP研究菌株的微進(jìn)化來(lái)判斷局部地區(qū)菌株群體結(jié)構(gòu)，適用于系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究[13]。長(zhǎng)片段多態(tài)性分析(LSP)和基于核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factors,NTF)基因分型法，可將北京家族菌株分為不同的亞型[14-15]。在NTF區(qū)域有1～2個(gè)IS6110插入時(shí)，為典型的“現(xiàn)代型”；若NTF區(qū)域完整，無(wú)IS6110插入序列，則為“古典型”。LSP中的長(zhǎng)片段RD105存在于所有的北京型菌株，故可作為北京家族菌株的鑒別方法。其他LSP，如RD181、RD142、RD150，能夠?qū)⒈本┘易寰昙?xì)分為不同的亞型，從而更加全面分析地北京型菌株的相關(guān)特征[14-16]。但是，SNP需要測(cè)序，價(jià)格昂貴，無(wú)法在實(shí)驗(yàn)室間推廣，SNP和LSP對(duì)菌株的分辨率不高，在追蹤傳染源、查找傳播途徑方面難以替代傳統(tǒng)的基因分型技術(shù)。

基因分型技術(shù)是結(jié)核病分子流行病學(xué)研究中的重要內(nèi)容，在結(jié)核病近期傳播追蹤、暴發(fā)流行調(diào)查、實(shí)驗(yàn)室污染鑒定、內(nèi)源性復(fù)染和外源性再感染的區(qū)分等方面具有重大意義。目前IS6110-RFLP、MIRU-VNTR和spoligotyping是國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)研究工作中最常用的三種方法，已有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程。MIRU-VNTR和spoligotyping已有相應(yīng)的國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站，便于各國(guó)研究者發(fā)布或比對(duì)數(shù)據(jù)。每個(gè)分型技術(shù)都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際工作中需要多種方法聯(lián)合應(yīng)用能夠提高分辨率，達(dá)到理想的分型效果。

[1]Chauhan D S,Sharma V D,Parashar D,et al.Molecular typing ofMycobacteriumtuberculosisisolates from different parts of India based on IS6110 element polymorphism using RFLP analysis [J].Indian J Med Res,2007,125(4):577-581.

[2]裴秀英,戴壽芝,王民,等.IS6110-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性DNA分型在結(jié)核分子流行病學(xué)研究中的應(yīng)用[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2002,25(1):18-20.

[3]Zhang L,Chen J,Shen X,et al.Highly polymorphic variable-number tandem repeats loci for differentiating Beijing genotype strains ofMycobacteriumtuberculosisin Shanghai,China[J].FEMS Microbiology Letters,2008,282(1):22-31.

[4]Supply P,Allix C,Lesjean S,et al.Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat typing ofMycobacteriumtuberculosis[J].J Clin Microbiol,2006,44(12):4498-4510.

[5]Alonso-Rodriguez N,Martinez-Lirola M,Herranz M,et al.Evaluation of the new advanced 15-loci MIRU-VNTR genotyping tool inMycobacteriumtuberculosismolecular epidemiology studies[J].BMC Microbiol,2008,8:34.

[6]Rovina N,Karabela S,Constantoulakis P,et al.MIRU-VNTR typing of drug-resistanttuberculosisisolates in Greece[J].Therapeut Adv Respirat Dise,2011,5(4):229-236.

[7]Hanekom M,van der Spuy G D,Gey van Pittius N C,et al.Discordance between mycobacterial interspersed repetitive-unit-variable-number tandem-repeat typing and IS6110 restriction fragment length polymorphism genotyping for analysis ofMycobacteriumtuberculosisBeijing strains in a setting of high incidence of tuberculosis[J].J Clin Microbiol,2008,46(10):3338-3345.

[8]Rao K R,Ahmed N,Srinivas S,et al.Rapid identification ofMycobacteriumtuberculosisBeijing genotypes on the basis of the mycobacterial interspersed repetitive unit locus 26 signature[J].J Clin Microbiol,2006,44(1):274-277.

[9]Al-Hajoj S,Varghese B,Al-Habobe F,et al.Current trends ofMycobacteriumtuberculosismolecular epidemiology in Saudi Arabia and associated demographical factors[J].Infect Genet Evolut,2013,16:362-368.

[10]Lu W,Lu B,Liu Q,et al.Genotypes ofMycobacteriumtuberculosisisolates in rural China:Using MIRU-VNTR and spoligotyping methods[J].Scandinavian J Infecti Dise,2014,46(2):98-106.

[11]Lamine-Khemiri H,Martinez R,Garcia-Jimenez W L,et al.Genotypic characterization by spoligotyping and VNTR typing ofMycobacteriumbovisandMycobacteriumcapraeisolates from cattle of Tunisia[J].Trop Ani Heal Product,2014,46(2):305-311.

[12]Tsolaki A G,Hirsh A E,DeRiemer K,et al.Functional and evolutionary genomics ofMycobacteriumtuberculosis:Insights from genomic deletions in 100 strains[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(14):4865-4870.

[13]董丹丹,高謙.結(jié)核分枝桿菌進(jìn)化與致病性的研究[J].微生物與感染,2010,5:106-110.

[14]Mokrousov I,Ly H M,Otten T,et al.Origin and primary dispersal of theMycobacteriumtuberculosisBeijing genotype:Clues from human phylogeography[J].Gen Res,2005,15(10):1357-1364.

[15]Tsolaki A G,Gagneux S,Pym A S,et al.Genomic deletions classify the Beijing/W strains as a distinct genetic lineage ofMycobacteriumtuberculosis[J].J Clin Microbiol,2005,43(7):3185-3191.

[16]Kurepina N E,Sreevatsan S,Plikaytis B B,et al.Characterization of the phylogenetic distribution and chromosomal insertion sites of five IS6110 elements inMycobacteriumtuberculosis:Non-random integration in the dnaA-dnaN region[J].Tuber Lung Dise,1998,79(1):31-42.

[責(zé)任編輯：李薊龍]

張志(1980-)，男，石家莊市人，碩士研究生，主管檢驗(yàn)師。

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10.3969/j.issn.1673-1492.2016.06.030

來(lái)稿日期：2016-02-27