許安東, 朱云祥, , 湯曉飛, 王光輝

(1. 揚(yáng)州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 普外科, 江蘇 揚(yáng)州, 225000;

2. 上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院 結(jié)直腸外科, 上海，200092)

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糞便中miRNA-424在結(jié)直腸癌診斷和篩查中的應(yīng)用

許安東1, 朱云祥1, 2, 湯曉飛1, 王光輝2

(1. 揚(yáng)州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 普外科, 江蘇 揚(yáng)州, 225000;

2. 上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院 結(jié)直腸外科, 上海，200092)

摘要:目的研究miRNA(miR-150, miR-424，miR-29b，miR-96)在結(jié)直腸癌組織和糞便中的表達(dá)情況。方法納入77例結(jié)直腸癌患者以及43名正常志愿者。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，對(duì)miRNA在結(jié)直腸癌患者與正常人群的糞便中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，并比較二者的差異。結(jié)果 miR-150在正常人群和結(jié)直腸癌患者糞便中表達(dá)有顯著差異(P<0.05); miR-424在正常組中的表達(dá)量顯著低于腫瘤組(P<0.05)。miR-29b和miR-96在兩種人群糞便中的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。miR-424的曲線下面積為0.756，而miR-150的曲線下面積為0.661。結(jié)論miR-424在結(jié)直腸癌患者和正常人群的糞便中表達(dá)存在明顯差異。

關(guān)鍵詞:microRNA; 結(jié)直腸癌; 腫瘤標(biāo)志; 診斷

結(jié)直腸癌作為世界上最常見的3種惡性腫瘤之一，也是腫瘤相關(guān)性死亡的主要原因[1]。盡管結(jié)直腸癌根治術(shù)已經(jīng)大大降低腫瘤的死亡率，但是腫瘤的晚期轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍然是患者死亡的主要原因。結(jié)直腸癌早期癥狀不明顯，患者診斷腫瘤往往已是中晚期，延誤了腫瘤的治療[2]。所以早期篩查和診斷是降低結(jié)直腸腫瘤死亡率和提高患者預(yù)后的重要措施[3]。

目前已有一些檢驗(yàn)方法和蛋白標(biāo)記物用于檢測(cè)早期結(jié)直腸癌，如糞便隱血試驗(yàn)、癌胚抗原(CEA)、CA125、CA19-9等。但是這類檢驗(yàn)方法以及蛋白標(biāo)記物的敏感性不強(qiáng)，無法達(dá)到檢測(cè)早期腫瘤的目的[4-5]。結(jié)腸鏡和病理檢查是當(dāng)前診斷結(jié)直腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)臨床指南，其適用于50歲甚至更高年齡的人群[6]。由于結(jié)直腸鏡檢查前需要做腸道準(zhǔn)備，可能會(huì)造成被檢者的不適，以及費(fèi)用較高等因素，并沒有在發(fā)展中國家得到廣泛的使用[7-8]。影像學(xué)檢查如CT和MRI都是非常有效和非侵入性的檢查，但是輻射、高費(fèi)用以及對(duì)早期腸道腫瘤的檢出率低影響了其在篩查結(jié)直腸癌中的應(yīng)用[9]。

MicroRNA是一類由18～25個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA家族，參與調(diào)控近1/3的人類基因，影響細(xì)胞的增殖、遷徙、轉(zhuǎn)移、凋亡等功能。它的異常表達(dá)在多種腫瘤中得到證實(shí)，包括結(jié)直腸癌[10-11]。Ahmed等[12]在5位正常志愿者和15位腸癌患者的糞便中發(fā)現(xiàn)，miR-21、miR-203、miR-20a、miR-326、miR-92等在腫瘤患者的糞便中表達(dá)上調(diào)，而miR-320、miR-126、miR-484-5p、miR-145、miR-16、miR-125b等則相反。在作者前期的篩查中發(fā)現(xiàn)，miR-150在正常組織中的表達(dá)量比腫瘤組織高，而miR-106b，miR-96和miR-424在腫瘤組織中的表達(dá)相對(duì)于正常組織明顯升高[13]。由此作者設(shè)想，糞便中這4種miRNA在腫瘤患者和正常人群糞便中的表達(dá)量可能存在差異，并且有望成為一類非侵入性腫瘤標(biāo)記物來篩查和診斷結(jié)直腸癌。

1材料與方法

1.1糞便標(biāo)本

本次研究中，作者納入了新華醫(yī)院結(jié)直腸癌診治中心77例結(jié)直腸癌患者以及43例正常志愿者，收集其糞便標(biāo)本。排除患有炎癥性腸病、腹瀉、腸道功能紊亂以及曾接受過腸道手術(shù)、放化療的患者。本實(shí)驗(yàn)通過了新華醫(yī)院倫理委員會(huì)，每位參與者都簽訂了知情同意書。

1.2總RNA的提取及RT-PCR

使用Omega 糞便RNA提取試劑盒(R6828-01)提取所有參與試驗(yàn)的志愿者糞便中的總RNA, 用Biotend試劑盒進(jìn)行一步法熒光定量PCR, 引物序列為hsa-miR-150: UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG；hsa-miR-29b: GCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGA；hsa-miR-96: UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU; hsa-miR-424：CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA。U6選作該實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參，引物均由上海拓然生物公司合成，采用相對(duì)表達(dá)量評(píng)估基因表達(dá)水平，采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)用非參數(shù)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)比miRNA的表達(dá)差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；圖表均使用Graphpad 5.0制作。

2結(jié)果

采用熒光定量PCR對(duì)所有參與該實(shí)驗(yàn)的120例志愿者糞便中miRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，包括77例腫瘤患者和43例正常志愿者。腫瘤患者中男40例，女37例；年齡<60歲53例，≥60歲24例；直腸癌36例，結(jié)腸癌41例；患者優(yōu)8例，良67例，差2例；腫瘤大小為≤3 cm者25例，3～5 cm者23例，≥5 cm者29例；腫瘤分期T1者3例，T2者15例，T3者40例，T4者19例；淋巴轉(zhuǎn)移N0者26例，N1者30例，N2者21例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M0者64例，M1者13例；疾病分期Ⅰ級(jí)11例，Ⅱ級(jí)13例，Ⅲ級(jí)41例，Ⅳ級(jí)13例。

作者發(fā)現(xiàn)miR-150在腫瘤患者糞便中的表達(dá)量明顯要低于正常志愿者(P<0.05), miR-424在腫瘤患者糞便中的表達(dá)量相對(duì)于正常志愿者明顯升高(P<0.05), 但是miR-29b和miR-96在腫瘤患者和正常志愿者糞便中的表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

運(yùn)用ROC曲線法進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn), miR-424和miR-150的曲線下面積(AUC)為0.756(標(biāo)準(zhǔn)誤為0.047,P<0.001)和0.661(標(biāo)準(zhǔn)誤為0.049,P=0.001)。另外, miR-424對(duì)結(jié)直腸癌的診斷具有69.94%的敏感性和74.42%的特異性，而miR-150的特異性和敏感性為72.5%和54.5。見圖2。

3討論

結(jié)直腸腫瘤是全世界最常見的腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清除，目前最有效的治療還依賴于結(jié)直腸腫瘤切除[14-18]。盡管根治性切除已經(jīng)大大降低了結(jié)直腸癌的死亡率，但是晚期的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移依舊是腫瘤患者死亡的主要原因[19-21]。由于結(jié)直腸癌早期癥狀不明顯，往往使得很多患者失去了早期治療的機(jī)會(huì)，所以早期診斷成了預(yù)防和治愈結(jié)直腸癌的重要環(huán)節(jié)[22-24]。

目前許多檢查如血清指標(biāo)、腸鏡檢查以及一些先進(jìn)的影像學(xué)檢查，由于準(zhǔn)確率不高，敏感性不強(qiáng)以及價(jià)格較昂貴等原因，不適用于早期結(jié)直腸癌的篩查和診斷[24-26]。另外一些分子生物指標(biāo)出現(xiàn)，并有望用于結(jié)直腸癌的早期診斷，例如血清中miRNA等也起到了預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌的目的，但是血清中這類指標(biāo)穩(wěn)定性較差。相比較而言，糞便中的miRNA的穩(wěn)定性和提取難易程度要優(yōu)化很多[25]。

A: miR-150在CRC患者糞便中表達(dá)量明顯比正常志愿者低; B: miR-424在CRC患者糞便中表達(dá)量明顯比正常志愿者高；

圖2miR-150和miR-424的ROC曲線分析

關(guān)于miRNA作為生物指標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌的相關(guān)報(bào)道并不是很全面。有研究[26]通過檢測(cè)糞便中miRNA發(fā)現(xiàn)，miR-135b在正常志愿者、腺瘤以及結(jié)直腸癌患者糞便中的表達(dá)量呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。miR-150具有抑制結(jié)直腸腫瘤生長(zhǎng)的作用，其表達(dá)下調(diào)與結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)[27], miR-424具有促進(jìn)結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[28]。本研究結(jié)果顯示，miR-150在結(jié)直腸癌患者糞便中的表達(dá)量明顯比正常志愿者低，而miR-29b和miR-96在二者糞便中的表達(dá)量無顯著差異。另外運(yùn)用曲線下面積(AUC)分析miR-150和miR-424對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)測(cè)效果發(fā)現(xiàn)，二者的曲線下面積分別為0.756和0.661，miR-424對(duì)結(jié)直腸癌診斷的敏感性為69.94%，特異性為74.42%，而miR-150的特異性和敏感性為72.5%和54.5。AUC>0.5時(shí)，AUC越靠近1, 診斷效果越好。AUC在 0.5～0.7時(shí)準(zhǔn)確性較低，AUC在0.7以上時(shí)準(zhǔn)確性較好。

通過本次實(shí)驗(yàn)作者發(fā)現(xiàn)，miR-424在結(jié)直腸癌患者糞便中的表達(dá)量相比于正?；颊呱险{(diào)明顯，與腫瘤組織中miR-424表達(dá)高于正常組織的趨勢(shì)一致，證明miR-424有望成為結(jié)直腸癌早期篩查和診斷的腫瘤標(biāo)志物。由于miR-150對(duì)結(jié)直腸癌的診斷準(zhǔn)確性較低，不適用于早期診斷和篩查。

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Application of fecal miRNA-424 in screening and diagnosis of colorectal cancer

XU Andong1, ZHU Yunxiang1, 2, TANG Xiaofei1, WANG Guanghui2

(1.DepartmentofGeneralSurgery,TheSecondSchoolofClinicalMedicineofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225001; 2.DepartmentofColorectalSurgery,XinhuaHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai, 200092)

ABSTRACT：ObjectiveTo investigate the expressions of miRNA (miR-150, miR-424, miR-29b, miR-96) in the tissues of colorectal cancer (CAC) and feces. MethodsA total of 77 patients with CRC and 43 healthy volunteers were selected, and the real-time PCR method was used to evaluate the miRNA expression in the feces of the patients with CAC and healthy volunteers. ResultsSignificant difference of the miR-150 expression was found between the feces of patients with CRC and healthy volunteers (P<0.05), and miR-424 expression in the normal group was significantly lower than the tumor group (P<0.05). There were no significant differences in expressions of miR-29b and miR-96 between the patients with CAC and healthy volunteers (P>0.05). The area under the curve (AUC) of miR-424 was 0.756, and 0.661 for miR-150. ConclusionThere is significant difference of miR-424 expression between the feces of the patients with CAC and healthy volunteers.

KEYWORDS:microRNA; colorectal cancer; biomarker; diagnosis.

通信作者:朱云祥

基金項(xiàng)目:中國博士后科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目(2012M510859)

收稿日期:2015-10-23

中圖分類號(hào):R 735.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2016)01-016-04

DOI:10.7619/jcmp.201601005