徐寒子, 貢　震, 陸諤梅, 孫志華,

吳　強1, 季明華1, 唐金海1，2

(1. 南京醫(yī)科大學附屬江蘇省腫瘤醫(yī)院, 江蘇 南京, 210009;

2. 南京中醫(yī)藥大學, 江蘇 南京, 210023;

3. 南京醫(yī)科大學附屬南京婦幼保健院, 江蘇 南京, 210004)

?

人免疫重建荷子宮內(nèi)膜癌SCID小鼠動物模型的建立

徐寒子1，2, 貢震3, 陸諤梅1, 孫志華1,

吳強1, 季明華1, 唐金海1，2

(1. 南京醫(yī)科大學附屬江蘇省腫瘤醫(yī)院, 江蘇 南京, 210009;

2. 南京中醫(yī)藥大學, 江蘇 南京, 210023;

3. 南京醫(yī)科大學附屬南京婦幼保健院, 江蘇 南京, 210004)

摘要：目的構建人免疫重建皮下荷人子宮內(nèi)膜癌移植瘤SCID小鼠模型。方法將SCID小鼠隨機分成空白對照組、單純免疫重建組、荷瘤組及模型組，分別經(jīng)腹腔注射人淋巴細胞和(或)皮下接種HEC-1B細胞建立相應模型。觀察荷瘤鼠成瘤、移植瘤生長及組織學特征；ELISA法檢測小鼠血清中人IgG含量，流式細胞術、免疫組化法檢測小鼠外周血及脾臟T細胞表型。結果小鼠成瘤率均為100%，但模型組小鼠成瘤潛伏期延長、移植瘤生長受限。單純免疫重建組及模型組小鼠外周血、脾臟分別可檢出人IgG及人T淋巴細胞表型。未發(fā)現(xiàn)移植物抗宿主情況，空白對照組、單純免疫重建組、模型組小鼠體質(zhì)量無顯著差異。結論初步建立了人免疫重建荷人子宮內(nèi)膜癌SCID小鼠復合模型。

關鍵詞:子宮內(nèi)膜惡性腫瘤; 疾病模型; 動物; SCID小鼠

SCID小鼠是1983 年Bosma[1-2]首次報道的一種以細胞和體液嚴重聯(lián)合免疫缺陷為特征的近交系小鼠，目前國內(nèi)外已有用SCID小鼠重建人免疫系統(tǒng)并移植人類腫瘤成功的報道，尚鮮見人免疫重建荷人子宮內(nèi)膜癌的復合小鼠模型見諸報道。本研究選擇預處理的SCID小鼠作為載體，通過腹腔注射人淋巴細胞，皮下種植人子宮內(nèi)膜癌細胞，建立人免疫重建、皮下荷人子宮內(nèi)膜癌移植瘤的SCID小鼠模型，以期為子宮內(nèi)膜癌的生物學研究及治療學評價提供體內(nèi)實驗研究平臺。

1材料與方法

1.1主要試劑

小牛血清購自杭州四季青公司，培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，人淋巴細胞分離液為挪威Axis-Shield PoC AS公司產(chǎn)品，人IgG ELISA檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物，F(xiàn)ITC標記的鼠抗人CD3單抗為美國BD公司產(chǎn)品

1.2細胞

人子宮內(nèi)膜腺癌細胞株HEC-1B購自中科院上海細胞庫。細胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h換液1次，0.25%胰蛋白酶消化傳代。細胞呈單層貼壁生長，收集對數(shù)生長期細胞以PBS重懸，調(diào)細胞濃度為2×107/mL進行實驗。

1.3動物

CB-17 SCID小鼠，4～6周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，SPF無菌條件下飼養(yǎng)，無免疫滲漏(ELISA法測定鼠血清IgG水平≤10 μg/mL)的入組實驗。

1.4方法

1.4.1分離人外周血淋巴細胞PBL: 抽取健康志愿者外周血，采用密度梯度離心法，以人淋巴細胞分離液分離得到人外周血單個核細胞(PBMC)作為PBL，PBS重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為8×107/mL。

1.4.2小鼠復合模型的建立：24只SCID小鼠于建模前1 d接受3.5 Gy全身照射后隨機分成4組，每組6只。A組為空白對照組，不進行免疫重建，皮下和腹腔僅注射PBS; B組為單純荷瘤組，于每鼠后肢內(nèi)側(cè)皮下接種3×106個HEC-1B細胞，腹腔僅注射PBS而未行免疫重建；C組為單純免疫重建組，經(jīng)每鼠腹腔注射5×107個PBMC，每鼠后肢內(nèi)側(cè)皮下僅注射PBS而未行移植瘤的皮下種植；D組為復合模型組，于每鼠后肢內(nèi)側(cè)皮下接種3×106個HEC-1B細胞，腹腔注射5×107個PBMC。

1.5復合模型的鑒定

1.5.1小鼠生物學體征觀察：觀察小鼠的精神狀態(tài)、活力、營養(yǎng)狀態(tài)等，以及是否出現(xiàn)皮疹、腹瀉步態(tài)改變等表現(xiàn)，異種移植物抗宿主病(GVHD)診斷標準參照文獻判定[3]。

1.5.2移植瘤生長檢測：用卡尺檢查測量荷瘤鼠瘤體生長情況并判斷潛伏期及成瘤率，經(jīng)測量瘤體最長徑D和最短徑d后按公式Dd2/2計算腫瘤近似體積[4]，繪制移植瘤生長曲線。

1.5.3組織觀察：建模后6周處死小鼠稱重，取小鼠脾臟、移植瘤組織，以福爾馬林固定、石蠟包埋、切片染色后鏡檢。

1.6免疫重建的鑒定

ELISA檢測小鼠外周血人IgG: 建模后每周斷尾取血300 μL，離心得約120 μL待測血清樣品。按人IgG-ELISA試劑盒使用說明操作：抗人IgG單抗4℃包被過夜于酶板上后，將標準品和待測樣品100 μL加于上述包被板37 ℃孵育1 h, 使人IgG與單抗結合；再加入100 μL標記后的抗人IgG抗體37 ℃孵育1 h, 洗滌后加入顯色液顯色0.5 h, 最后上酶標儀測OD值，并通過標準曲線計算人IgG含量。

流式細胞術檢測小鼠外周血T細胞(CD3+細胞)比例：處死小鼠后取小鼠外周血樣品經(jīng)溶血素破紅5 min, 加CD3單抗或?qū)φ湛贵w4 ℃孵育30 min，PBS洗滌，最后上流式細胞儀檢測。取前述石蠟包埋備用的小鼠脾臟組織，按免疫組化S-P法操作，檢測人淋巴細胞(CD3+細胞)的存在。

1.7統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析，均值以均數(shù)±標準差表示，計量資料兩組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1小鼠生物學體征

所有小鼠在6周內(nèi)均存活。荷瘤組小鼠出現(xiàn)了不同程度的精神萎靡、目光呆滯、行動遲緩、毛色黯淡雜亂等表現(xiàn)；而免疫重建組小鼠(包括了復合模型組小鼠)未出現(xiàn)明顯的行為及生活習性的改變，也未觀察到皮疹、腹瀉等癥狀發(fā)生，處死小鼠后主要臟器檢查亦無明顯GVHD。荷瘤組小鼠體質(zhì)量較其他各組顯著減輕，余各組間無顯著差異(見圖1)，提示本法安全可靠。

圖1 建模后6周,荷瘤組小鼠體質(zhì)量較其他各組顯著減輕(P<0.05),余各組間無顯著差異

2.2小鼠移植瘤生長情況

SCID小鼠皮下接種HEC-1B細胞后，單純荷瘤組成瘤潛伏期約1周左右；而復合模型組小鼠潛伏期需要10～14 d, 較單純荷瘤組明顯延長。單純荷瘤組和復合模型組小鼠成瘤率均為100%；但同期2組小鼠移植瘤體大小相比較，復合模型組小鼠顯著小于單純荷瘤組小鼠(P<0.05), 見圖2。建模6周后處死小鼠，瘤體可見腫瘤細胞豐富，結構混亂(見圖3A、C); 復合模型組存在一定程度的淋巴細胞浸潤(見圖3B), 而單純荷瘤組則不甚明顯(見圖3D)。

2.3免疫重建的鑒定

2.3.1小鼠人B淋巴細胞重建檢測：免疫重建小鼠外周血100%可檢測到人IgG; 在建模后6周的時間內(nèi)，人IgG含量隨時間的延長而逐漸升高；同期下復合模型組顯著高于單純免疫組(P<0.05), 見圖4。而單純荷瘤組與空白對照組則無顯著差異，均為本底檢測量。

圖2 小鼠皮下移植瘤生長對比

圖3　小鼠皮下移植瘤鏡下所見: A. 復合模型組; C. 單純荷瘤組

2.3.2小鼠人T淋巴細胞重建檢測：建模后6周處死小鼠提取脾，以免疫組化方法檢測小鼠脾臟人T淋巴細胞，單純免疫重建組、復合模型組小鼠脾臟可見人CD3+的T淋巴細胞(見圖5 C、D, 棕色細胞)，而空白對照組及單純荷瘤組小鼠脾臟未見人CD3+的T淋巴細胞(見圖5A、B)。以流式細胞術檢測小鼠外周血人T淋巴細胞(CD3+細胞)比例，結果顯示在免疫重建后6周復合模型組略高于單純免疫組。而單純荷瘤組與空白對照組未見明顯人T淋巴細胞存在(見圖5E)。

圖5 小鼠脾臟及外周血免疫重建

3討論

子宮內(nèi)膜癌(EMC)是起源于子宮內(nèi)膜腺體的惡性腫瘤，又稱子宮體癌。子宮內(nèi)膜癌是女性生殖器3大惡性腫瘤之一，約占女性癌癥總數(shù)的7%，占生殖道惡性腫瘤20%～30%[5]。子宮內(nèi)膜癌近年來發(fā)病率在世界范圍內(nèi)明顯上升，僅次于宮頸癌，在歐美等發(fā)達國家已超過宮頸癌，成為女性生殖道最常見的惡性腫瘤[6]。

截止目前，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制尚不完全清楚。子宮內(nèi)膜癌早期患者經(jīng)手術治療預后較好，但治療后復發(fā)率達15%～20%；而晚期及復發(fā)患者經(jīng)激素治療或放化療后中位生存期<1年[7]。因此，對于子宮內(nèi)膜癌生物學與治療學的研究具有重要的現(xiàn)實意義。

子宮內(nèi)膜癌動物模型是子宮內(nèi)膜癌生物學研究及治療學評價的重要工具。當前，實驗性子宮內(nèi)膜癌動物模型主要為移植模型[8]，此外可見誘發(fā)模型的少量報道[9]。由于誘發(fā)模型的腫瘤與人類存在較大差異，且存在誘導時間長(>23周)、成瘤率低(48%)等缺陷[9]，目前多數(shù)研究采用人-裸鼠移植模型。但裸鼠缺乏重要的抗腫瘤免疫系統(tǒng)，因此人-裸鼠移植模型仍無法完全模擬人體真實的體內(nèi)環(huán)境，進而不便用于子宮內(nèi)膜癌生物學特性(如腫瘤免疫耐受、免疫逃逸)的研究及治療學(如生物、免疫治療)的評價。因此，隨著腫瘤生物學和治療學研究的發(fā)展，對于子宮內(nèi)膜癌缺乏一種可靠的與時俱進的體內(nèi)研究模型。

嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCID)的出現(xiàn)，為腫瘤體內(nèi)模型的建立提供了更好的選擇。SCID小鼠由CB17 近交小鼠16號常染色體scid隱性基因突變而來，該突變破壞了免疫球蛋白基因和T細胞受體基因的重組，導致缺乏成熟的功能性T、B 細胞[10]。SCID小鼠是一種先天性T 和B 細胞雙重免疫缺陷動物，不僅可成功移植人腫瘤細胞，而且可利用人類有關免疫細胞進行免疫功能重建，適合于研究人類免疫細胞和人類腫瘤的關系。與單純T淋巴細胞缺乏的裸小鼠相比，是更好的異種移植活體承載系統(tǒng)[11-12]。

就重建免疫的材料而言，當前主要包括人胎兒胸腺、臍血細胞、成人外周血造血干細胞、成人外周血淋巴細胞等；就免疫重建的途徑而言，也可分為靜脈與腹腔注射兩類[13]。其中以經(jīng)腹腔注射人外周血淋巴細胞最為簡便、有效，最有實用價值。因此本實驗選擇SCID小鼠作為載體，通過皮下種植人子宮內(nèi)膜癌細胞、腹腔注射人淋巴細胞來建立復合模型。

鑒于SCID鼠仍具有其固有免疫如自然殺傷細胞NK、淋巴因子活化的殺傷細胞LAK、巨噬細胞等排斥植入的異種組織，所以實驗前SCID小鼠往往需要殺傷固有免疫細胞的預處理，如全身照射或抑制固有免疫細胞功能的藥物等[14-15]。本實驗于建模前1 d對SCID 鼠進行了3.5 Gy全身照射預處理，基本排除了固有免疫細胞作用的干擾。

當然，免疫系統(tǒng)的重建成功也與淋巴細胞的注射數(shù)量密切相關。數(shù)量不足，可能難以成功建立人免疫系統(tǒng)；數(shù)量過度，又容易誘發(fā)GVHD。本實驗在腹腔注射5×107個人淋巴細胞后1～2周，單純重建組及復合模型組小鼠外周血即可檢測出人IgG, 人T淋巴細胞，且隨時間的延長而逐漸增高，一定意義上代表了小鼠體內(nèi)在建模后的6周內(nèi)已初步建立了人細胞、體液免疫，同時也提示5×107個淋巴細胞是比較適宜的移植數(shù)量。由于脾臟參與了免疫效應細胞的歸巢與再循環(huán)[16]，因此建模后6周作者又對小鼠脾臟進行檢測，結果對單純重建組及復合模型組均可檢出人CD3+T淋巴細胞，提示小鼠體內(nèi)已成功建立了人免疫系統(tǒng)。

皮下移植瘤的監(jiān)測結果顯示成瘤率100%，經(jīng)過對移植瘤組織學檢查證實HEC-1B細胞在SCID 鼠皮下移植成功。鑒于單純荷瘤組成瘤潛伏期明顯短于復合模型組，瘤體大小亦顯著大于復合模型組，提示重建的人免疫細胞可能已在局部發(fā)揮了抗腫瘤免疫效應。

綜上所述，本實驗成功建立了人免疫重建荷人子宮內(nèi)膜癌SCID小鼠復合模型，該模型較好地模擬了子宮內(nèi)膜癌的體內(nèi)發(fā)生發(fā)展情況，是子宮內(nèi)膜癌生物學研究和治療學評價的理想平臺。

參考文獻

[1]Ye F, Chen H, Liang Z, et al. Establishment of a cervical cancer model via inoculating SiHa Cells into humanized severe combined immunodeficient mice[J]. Eur J Gynaecol Oncol, 2006, 27(6)：566.

[2]Seitz G, Pfeiffer M, Fuchs J, et al. Establishment of a rhabdomyosarcoma xenograft model in human-adapted mice[J]. Oncol Rep, 2010, 24(4): 1067.

[3]Williamson LM, Warwick RM. Transfusion-associated graft-versus-host disease and its prevention[J]. Blood Rev, 1995, 9(4): 251.

[4]Rosato A, Zoso A, Dalla Santa S, et al. Predicting tumor outcome following cancer vaccination by monitoring quantitative and qualitative CD8+ T cell parameters[J]. J Immunol, 2006, 176(3): 1999.

[5]Marnitz S, K?hler C. Current therapy of patients with endometrial carcinoma. A critical review[J]. Strahlenther Onkol, 2012, 188(1): 12.

[6]Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(1): 5.

[7]Gurumurthy M, Somoye G, Cairns M, et al. An update on the management of uterine carcinosarcoma[J]. Obstet Gynecol Surv, 2011, 66(11): 710.

[8]Kamat AA, Merritt WM, Coffey D, et al. Clinical and biological significance of vascular endothelial growth factor in endometrial cancer[J]. Clin Cancer Res, 2007, 13(24): 7487.

[9]Niwa K, Tanaka T, Mori H, et al. Rapid induction of endometrial carcinoma in ICR mice treated with N-methyl-N-nitrosourea and 17 beta-estradiol[J]. Jpn J Cancer Res, 1991, 82(12): 1391.

[10]Nonoyama S, Ochs HD. Immune deficiency in SCID mice[J]. Int Rev Immunol, 1996, 13(4): 289.

[11]Pearson T, Greiner DL, Shultz LD. Humanized SCID mouse models for biomedical research[J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2008, 324: 25.

[12]Thomsen M, Galvani S, Canivet C, et al. Reconstitution of immunodeficient SCID/beige mice with human cells: applications in preclinical studies[J]. Toxicology, 2008, 246(1): 18.

[13]Van Duyne R, Pedati C, Guendel I, et al. The utilization of humanized mouse models for the study of human retroviral infections[J]. Retrovirology, 2009, 6: 76.

[14]Boynton E, Aubin J, Gross A, et al. Human osteoblasts survive and deposit new bone when human bone is implanted in SCID mouse[J]. Bone, 1996, 18(4): 321.

[15]Matsuura Y, Yagi H, Matsuda S, et al. Human liver-specific nanocarrier in a novel mouse xenograft model bearing noncancerous human liver tissue[J]. Eur Surg Res, 2011, 46(2): 65.

[16]Serody JS, Burkett SE, Panoskaltsis-Mortari A, et al. T-lymphocyte production of macrophage inflammatory protein-1alpha is critical to the recruitment of CD8(+) T cells to the liver, lung, and spleen during graft-versus-host disease[J]. Blood, 2000, 96(9): 2973.

Establishment of a hu-PBL-SCID mouse xenograft model of human endometrial cancer

XU Hanzi1，2, GONG Zhen3, LU Emei1, SUN Zhihua1,WU Qiang1, JI Minghua1, TANG Jinhai1, 2

(1.JiangsuTumorHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210009；2.NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing,Jiangsu, 210023;3.NanjingMaternalandChildHealthCareHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210004)

ABSTRACT:ObjectiveTo establish a chimeric mouse model of endometrial cancer. MethodsPre-treated SCID mice were divided into 4 groups, including blank control, humanized control, xenograft control and chimeric model, which would be transplanted with human peripheral blood lymphocyte (PBL) intraperitoneally and/or injected with human endometrial cancer cells HEC-1B subcutaneously. The tumor growth was observed. Human immunoglobulin (IgG) and human T cells were assayed by ELISA, flowcytometry and immunochemistry (IHC) respectively. ResultsThe tumorigenecity rate of the model mice was 100%. Compared with xenograft control mice, the tumor size of chimeric model mice significantly depressed (P<0.05). Human IgG and T lymphocytes were observed in mice peripheral blood and spleen of humanized control and chimeric model groups. No GVHD was observed and the mouse weights among blank control, humanized control and chimeric model groups had no significant differences. ConclusionA hu-PBL-SCID mouse xenograft model of human endometrial cancer has been established successfully.

KEYWORDS:endometrial neoplasm; disease models; animal; SCID mouse

基金項目:國家自然科學基金項目(81202007); 江蘇省腫瘤醫(yī)院院基金項目(ZQ20120117)

收稿日期:2015-09-20

中圖分類號:R 737.33

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)01-008-05

DOI:10.7619/jcmp.201601003