張歲，佟立新，閆寶勇，李全海，賈蓓，柳立平，馬文波，張君

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人臍血干細胞經(jīng)外周靜脈移植治療失代償期肝硬化的臨床研究

張歲，佟立新，閆寶勇△，李全海，賈蓓，柳立平，馬文波，張君

摘要：目的探討人臍血干細胞經(jīng)外周靜脈移植治療不同程度肝硬化患者的療效及安全性。方法失代償期肝硬化患者65例，分為干細胞組34例，其中Child-Pugh A級13例、B級14例、C級7例，在常規(guī)保肝治療的基礎上給予臍血干細胞移植治療；對照組31例，其中Child-Pugh A級11例、B級13例、C級7例，給予常規(guī)保肝治療。于治療后2、4、12及24周觀察不同程度肝硬化患者肝功能和凝血功能變化，并觀察臨床癥狀改善以及不良反應發(fā)生情況。結果（1）臨床癥狀改善情況：Child-Pugh A、B級患者干細胞組臨床癥狀較對照組明顯改善。Child-Pugh C級患者2組臨床癥狀改善程度差異無統(tǒng)計學意義。（2）肝功能和凝血功能改善情況：Child-Pugh A、B級患者干細胞組白蛋白（ALB）、凝血酶原活動度（PTA）治療后2、4、12、24周均較治療前升高，且干細胞組于12、24周均較對照組升高；干細胞組膽堿酯酶（CHE）治療后4、12、24周均較治療前升高，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；2組丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）比較差異均無統(tǒng)計學意義。干細胞組Child-Pugh C級患者治療后ALT、AST、TBIL、ALB、CHE、PTA與治療前及對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義。（3）所有患者均未發(fā)生嚴重不良反應及并發(fā)癥。結論經(jīng)外周靜脈移植臍血干細胞治療失代償期肝硬化患者安全有效，Child-Pugh A、B級患者的療效優(yōu)于Child-Pugh C級患者。

關鍵詞：臍血干細胞移植；肝硬化；治療；觀察

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2012年9月—2015年6月于我院中西醫(yī)結合肝病診療中心住院的失代償期肝硬化患者65例，采用隨機數(shù)字表法分為干細胞組和對照組。干細胞組34例，其中男20例，女14例，年齡34～74歲，平均（55.62±9.56）歲；乙型肝炎肝硬化30例、丙型肝炎肝硬化2例、原發(fā)性膽汁性肝硬化1例、酒精性肝硬化1例。Child-Pugh分級：A 級13例、B級14例、C級7例。對照組31例，其中男18例，女13例，年齡33～71歲，平均（55.10±9.21）歲；乙型肝炎肝硬化28例、丙型肝炎肝硬化1例、原發(fā)性膽汁性肝硬化1例、酒精性肝硬化1例。Child-Pugh分級：A級11例、B級13例、C級7例。診斷符合2000年《病毒性肝炎防治方案》中肝硬化的臨床診斷標準。排除標準：重型肝炎急性期、已確診有肝癌、嚴重的心肺腦疾病以及衰竭狀態(tài)、高度過敏體質、有精神疾病者。所有患者均給予保肝降酶等綜合內科治療，干細胞組在此基礎上給予臍血干細胞治療。本研究得到醫(yī)院倫理委員會許可，并征得患者及家屬的知情同意，簽署知情同意書。2組患者的年齡（t=0.223）、性別（χ2=0.004）、Child-Pugh分級（χ2=0.065）、肝硬化病因（P=1.000）差異均無統(tǒng)計學意義。

1.2臍血采集選擇健康產(chǎn)婦，排除乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒及其他傳染性疾病，無病理妊娠者。胎兒娩出并斷臍后，用裝有ACD-B保存液的一次性采血袋以封閉式采血法采血，每袋采臍血約60～140mL備用。

1.3臍血干細胞的分離采用細胞處理試劑盒[寧夏中聯(lián)達生物有限公司（外周血、骨髓、臍帶血有核細胞分離液）寧（銀）食藥監(jiān)測（準）字2011第1400021號]分離臍血干細胞。經(jīng)流式細胞儀檢測，結果顯示：表達干細胞標志CD34、CD45，說明臍血干細胞分離培養(yǎng)成功。細胞活性檢測大于95%，細胞內毒素檢測陰性。單次移植提取的臍血干細胞總數(shù)為（0.7～2）×108/L，平均1.0×108/L，以0.9%氯化鈉注射液稀釋至100mL。

1.4移植途徑與方法患者取仰臥位，采用外周靜脈途徑建立靜脈留置針，使用輸血器輸注臍血干細胞。輸注臍血干細胞前20min給予苯海拉明注射液20mg肌內注射，0.9%氯化鈉溶液建立靜脈通路，再給予臍血干細胞靜脈滴注。滴注時注意控制滴速，100mL懸液滴注30min。

1.5術后隨訪2組患者治療前和治療后2、4、12、24周檢查肝功能：丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（to?tal bilirubin，TBIL）、白蛋白（albumin，ALB）、膽堿酯酶（cholin?esterase，CHE）。凝血功能：凝血酶原活動度（prothrombin ac?tivity，PTA），觀察臨床癥狀的改善情況、術后不良反應以及肝細胞癌的發(fā)生率、病死率。

1.6統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，2組治療前后各指標比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，組內多重比較采用LSD-t法。2組間比較采用成組t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1臨床癥狀的改善情況治療4周后，干細胞組Child-Pugh A、B級患者臨床癥狀改善率均高于對照組（P＜0.01或P＜0.05），見表1。2組Child-Pugh C級患者臨床癥狀改善率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

Tab.1　Changes of clinical symptoms in patients with Child-Pugh A and Child-Pugh B表1　Child-Pugh A、B級患者臨床癥狀的改善情況（例）

Tab.2　Changes of clinical symptoms in patients with Child-Pugh C表2　Child-Pugh C級患者臨床癥狀的改善情況（例）

2.22組Child-Pugh A、B級患者血液生物學指標的比較干細胞組ALB、PTA治療后2、4、12、24周較治療前升高（P < 0.05），且在12、24周較對照組升高（P < 0.05）。對照組ALB、PTA治療前后差異無統(tǒng)計學意義。干細胞組CHE治療后4、12、24周較治療前升高（P < 0.05），對照組CHE治療前后差異無統(tǒng)計學意義，且2組間CHE比較差異無統(tǒng)計學意義。2組間各時點ALT、AST、TBIL差異無統(tǒng)計學意義；2組TBIL治療后12周較治療前降低（P < 0.05），見表3。

2.32組Child-Pugh C級患者血液生物學指標的比較2組ALT、AST、TBIL、ALB、CHE、PTA治療后與治療前比較差異無統(tǒng)計學意義，組間比較差異也無統(tǒng)計學意義，見表4。

2.4不良反應的發(fā)生情況2組患者隨訪6個月均未發(fā)現(xiàn)嚴重不良反應及并發(fā)癥，無肝癌發(fā)生，無死亡患者。

Tab.3　Changes of blood biological indicators in patients with Child-Pugh A and Child-Pugh B表3　Child-Pugh A、B級患者各項血液生物學指標的變化　（±s）

Tab.3　Changes of blood biological indicators in patients with Child-Pugh A and Child-Pugh B表3　Child-Pugh A、B級患者各項血液生物學指標的變化?。ā纒）

＊P＜0.05；＊＊P＜0.01；ALT：F組間=0.427，F(xiàn)時間=2.241，F(xiàn)交互=0.285，均P＞0.05；AST：F組間=2.042，F(xiàn)時間=1.874，F(xiàn)交互=0.753，均P＞0.05；TBIL：F組間=0.378，F(xiàn)交互=0.326，均P＞0.05；F時間=3.272，P=0.013；ALB：F組間=1.333，F(xiàn)時間=2.138，均P＞0.05；F交互=3.912，P=0.004；CHE：F組間=0.105，F(xiàn)時間=1.256，均P＞0.05；F交互=2.994，P=0.028；PTA：F組間=3.608，P=0.063；F時間=5.326，P=0.001；F交互=3.442，P=0.015；a與同組0周比較，P＜0.05

組別干細胞組對照組t n ALT（U/L）F 27 24 0周35.76±23.60 39.00±25.17 0.475 2周36.13±21.78 37.88±21.58 0.288 4周33.99±18.44 38.59±16.31 0.939 12周32.41±16.64 37.46±23.75 0.886 24周30.65±13.56 31.34±16.76 0.163 1.536 1.078組別干細胞組對照組t n AST（U/L）F 27 24 0周38.39±22.91 50.39±36.40 1.425 2周39.99±22.27 43.90±31.87 0.542 4周36.50±16.99 43.20±25.25 1.114 12周33.59±14.62 44.40±24.31 1.949 24周33.49±15.15 42.44±29.63 1.381 2.537 0.867組別干細胞組對照組t n TBIL（μmol/L）F 27 24 0周32.19±21.19 31.05±14.09 0.223 2周31.00±19.39 27.21±12.48 0.819 4周31.04±18.24 28.33±14.68 0.580 12周28.64±17.82a25.19±14.71a0.748 24周29.52±15.96 27.55±9.59 0.524 1.606 1.800組別干細胞組對照組t n ALB（g/L）F 27 24 0周37.15±6.86 37.17±7.77 0.011 2周38.34±6.21a36.78±6.82 0.856 4周39.26±6.44a37.99±6.97 0.675 12周39.93±5.72a36.39±6.27 2.108＊24周39.77±6.11a36.30±6.02 2.039＊5.36＊＊1.330組別干細胞組對照組t n CHE（U/L）F 27 24 0周4 122.59±1 649.85 4 438.67±2 222.06 0.581 2周4 217.37±1 500.40 4 107.04±1 786.47 0.240 4周4 339.93±1 574.49a4 262.75±2 199.04 0.145 12周4 639.26±1 521.58a4 188.71±2 023.58 0.905 24周4 622.33±1 681.30a4 180.29±1 565.41 0.968 4.214＊0.757組別干細胞組對照組t n PTA（%）F 27 24 0周69.15±18.11 67.38±20.51 0.328 2周75.69±18.39a65.33±20.05 1.925 4周75.38±16.67a65.93±17.28 1.979 12周80.00±18.95a68.88±18.19 2.133＊24周80.31±21.56a67.83±15.33 2.469＊9.122＊＊0.701

Tab.4　Changes of blood biological indicators in patients with Child-Pugh C表4　Child-Pugh C級患者各項血液生物學指標的變化?。╪=7，±s）

Tab.4　Changes of blood biological indicators in patients with Child-Pugh C表4　Child-Pugh C級患者各項血液生物學指標的變化?。╪=7，±s）

ALT：F組間=2.931，F(xiàn)時間=0.571，F(xiàn)交互=0.556，均P＞0.05；AST：F組間=0.391，F(xiàn)交互=0.497，均P＞0.05；F時間=3.565，P=0.013；TBIL：F組間=1.268，F(xiàn)時間=0.150，F(xiàn)交互=0.860，均P＞0.05；ALB：F組間=0.009，F(xiàn)時間=1.902，F(xiàn)交互=1.205，均P＞0.05；CHE：F組間=1.004，F(xiàn)時間=0.407，F(xiàn)交互=0.561，均P＞0.05；PTA：F組間=1.993，F(xiàn)時間=0.440，F(xiàn)交互=0.862，均P＞0.05

組別干細胞組對照組t ALT（U/L）F 0周28.69±4.64 25.37±9.28 0.845 2周33.17±6.69 26.07±10.75 1.484 4周32.76±3.83 24.77±9.23 2.115 12周31.46±2.84 25.27±9.53 1.645 24周30.76±6.46 25.91±8.79 1.175 1.085 0.085組別干細胞組對照組t AST（U/L）F 0周37.01±8.78 35.99±7.10 0.241 2周37.94±12.15 33.89±7.19 0.760 4周42.01±14.09 40.37±10.36 0.248 12周42.87±11.94 37.31±8.38 1.008 24周37.41±8.37 34.94±6.99 0.600 1.892 2.231組別干細胞組對照組t TBIL（μmol/L）F 0周53.07±6.17 48.99±12.04 0.799 2周55.89±16.34 44.89±11.51 1.451 4周51.64±6.93 47.27±14.56 0.717 12周49.91±13.01 47.94±17.45 0.240 24周54.57±9.68 44.61±13.74 1.568 0.826 0.318組別干細胞組對照組t ALB（g/L）F 0周28.33±2.01 27.59±3.66 0.375 2周29.30±2.64 30.06±8.31 0.424 4周28.63±3.78 29.00±5.24 0.418 12周27.43±2.84 27.49±4.40 0.474 24周27.89±2.43 28.44±5.47 0.550 0.943 1.126組別干細胞組對照組t CHE（U/L）F 0周1 835.29±168.10 2 051.29±342.24 1.517 2周1 860.00±160.92 2 165.86±557.13 1.405 4周1 798.43±252.51 2 000.00±584.32 0.774 12周1 976.57±295.50 1 999.14±520.96 0.090 24周1 857.43±416.89 2 041.43±559.77 0.697 0.378 0.664組別干細胞組對照組t PTA（%）F 0周38.86±5.21 44.43±10.92 1.218 2周35.43±3.31 46.71±14.21 2.047 4周38.86±7.10 43.57±13.99 0.795 12周36.86±6.04 41.14±11.16 0.894 24周38.00±5.03 43.43±12.71 1.050 0.909 0.565

3　討論

3.1臍血干細胞移植治療肝硬化的研發(fā)前沿和臨床意義臍血干細胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有多向分化潛能的原始細胞。臍血干細胞來源廣泛，易于采集，其較骨髓干細胞及外周血干細胞更為原始，有更強的分化和增殖能力，且免疫原性弱，臨床應用無需配型[3]，適用于細胞治療。動物研究中，Shi等[4]用綠色熒光蛋白標記的人臍血干細胞通過直接肝內注射治療CCl4誘導的急性肝損傷大鼠，結果發(fā)現(xiàn)臍血干細胞移植能夠顯著改善急性肝損傷大鼠的生存率，其潛在機制可能為臍血干細胞可以分化為肝樣細胞并定向移位到肝臟的損傷部位發(fā)揮作用。臨床研究顯示臍血干細胞移植可以改善失代償期肝硬化患者的肝功能及臨床癥狀，安全性好[5-6]。但臍血干細胞移植對于不同程度肝硬化患者的療效是否一致，仍需進一步探討。本研究采用臍血干細胞移植治療失代償期肝硬化患者，設立對照組，對不同程度肝硬化患者的臨床療效進行了分析，為其應用提供了進一步臨床指導。

3.2臍血干細胞移植治療不同程度肝硬化的療效分析Child-PughA、B級患者干細胞組ALB和PTA治療后較治療前和對照組均升高，提示臍血干細胞移植可以改善肝臟合成ALB和凝血因子的功能，其可能機制為干細胞通過靜脈回輸后優(yōu)先到達受損傷或炎癥組織[7]，干細胞到達損傷的肝臟后：（1）可以抑制肝細胞的凋亡，還可以合成多種生長因子和細胞因子，通過旁分泌的作用促進肝細胞的再生[8]，增強肝臟的合成功能。（2）在肝臟微環(huán)境中可以分化為肝細胞[9-10]或與肝細胞融合，從而促進肝臟的修復再生，使肝臟合成功能增強。本研究顯示Child-PughA、B級患者2組ALT、AST、TBIL差異均無統(tǒng)計學意義，而ALT、AST、TBIL為肝臟炎癥損傷的指標，提示臍血干細胞無明顯改善肝臟炎癥損傷的作用。Child-Pugh C級患者2組ALT、AST、TBIL、ALB、CHE、PTA差異均無統(tǒng)計學意義，提示臍血干細胞對Child-Pugh C級患者的臨床療效不佳。分析其原因可能為：肝功能Child-Pugh C級時肝臟出現(xiàn)明顯肝竇變窄、血流受阻、肝內阻力增加，影響門靜脈血流動力學，造成肝細胞缺氧和養(yǎng)料供給障礙，且門脈壓力增高，加重肝細胞的營養(yǎng)障礙，植入的干細胞因沒有合適的微環(huán)境，影響其增殖分化發(fā)揮作用。但由于Child-Pugh C級患者例數(shù)少，可能對療效觀察有一定的影響，需加大樣本量進一步觀察。此外，本研究顯示Child-Pugh A、B級患者的臨床癥狀較Child-PughC級患者明顯改善。

綜上所述，經(jīng)外周靜脈回輸臍血干細胞治療失代償期肝硬化患者，能改善患者的肝功能、凝血功能和臨床癥狀，安全可靠，并且肝硬化的程度越輕，療效越好。但由于該項目開展時間尚短，病例數(shù)量少，隨訪時間較短，仍需擴大樣本長期隨訪觀察。

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（2015-01-27收稿2015-08-18修回）

（本文編輯李鵬）

Clinical study ofhuman umbilical cord blood stem cell transplantation via peripheral vein in the treatment of decompensated cirrhosis

ZHANG Sui, TONG Lixin, YAN Baoyong△, LI Quanhai, JIA Bei, LIU Liping,mA Wenbo, ZHANG Jun
Liver Disease Diagnoses and Treatment Center of Chinese Westernmedicine, the Firsthospital ofhebeimedical University, Shijiazhuang 050031, China
△Corresponding Author E-mail：yanbaoyong111@163.com

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect and safety ofhuman umbilical cord blood stem cell transplantation via peripheral vein in the treatment of different degrees of liver cirrhosis.Methods Sixty-five patients with liver cirrhosis were selected, and divided into stem cell group (n=34) and control group (n=31).Stem cell group included patients with different degrees of cirrhosis: 13 with Child-Pugh A, 14 with Child-Pugh B and 7 with Child-Pugh C respectively, patients in stem cell group were given intravenous infusion ofhuman umbilical cord blood stem cells via peripheral vein on the basis of rou?tine treatment.The changes of liver function and coagulation function were observed before transplantation, 2, 4, 12 and 24 weeks after transplantation.In addition, clinical symptoms and side effects in patients were observed after the stem cell treat?ment.Results (1) Clinical symptoms were improved obviously in patients with Child-Pugh A and B in stem cell group com?pared with those in control group.There were no significant differences in clinical symptoms in patients with Child-Pugh C between stem cell group and control group.(2) Liver of albumin (ALB), prothrombin activity (PTA) were significantly in?creased in patients with Child-Pugh A and B in stem cell group at 2, 4,12 and 24 weeks after treatment than those before treatment.Levels of ALB and PTA were increased in stem cell group at 12 and 24 weeks after treatment than those of control group.The level of cholinesterase (CHE) was increased in stem cell group at 4, 12 and 24 weeks after treatment than thosebook=84,ebook=89before treatment.There was no significant differences in level of CHE between stem cells group and control group.There was no significant differences in levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and total bilirubin (TBIL) between stem cell group and control group.There were no significant differences in ALT, AST, TBIL, ALB, CHE and PTA in patients with Child-Pugh C between stem cell group and control group.(3) There were no severe complications and adverse reactions in patients after treatment.Conclusionhuman umbilical cord blood stem cell transplantation via periph?eral vein is safe and effective for the treatment of liver cirrhosis.The curative effect ismuch remarkable in patients with Child-Pugh A and B than that in patients with Child-Pugh C.

Key words：cord blood stem cell transplantation；liver cirrhosis；therapy；observation肝移植是治療失代償期肝硬化的理想選擇，但因為肝來源缺乏、價格昂貴及移植后免疫排斥反應等限制了其臨床應用。干細胞移植技術的發(fā)展為肝硬化的治療提供了一個新思路。干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體，在體內外均有極強的向肝細胞分化的能力。研究表明，干細胞移植可以改善肝硬化患者的肝功能及臨床癥狀[1-2]，但對于不同程度肝硬化患者的療效是否一致，尚缺乏臨床對照研究。本研究通過分離臍血干細胞，并經(jīng)外周靜脈移植治療不同程度失代償期肝硬化患者，旨在對其臨床療效及安全性進行評價。

通訊作者△E-mail：yanbaoyong111@163.com

作者簡介：張歲（1982），女，碩士，主要從事肝病研究

基金項目：河北省科技計劃項目（12276102D）

中圖分類號：R575.2，R457

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/58304

作者單位：河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院中西醫(yī)結合肝病診療中心(郵編050031)