熊結(jié)標(biāo)

摘 要：CBF1基因的擴(kuò)增是研究植物抗旱基因的前期工作。本研究用Trizol試劑法提取模式植物擬南芥葉片的總RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物DNA回收后，連接PCR片段與T載體，電擊轉(zhuǎn)化入E. coli大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；涂平板長出菌落，挑取半個(gè)白斑菌落電泳鑒定轉(zhuǎn)化子；鑒定完成后提取質(zhì)粒，用雙酶切法進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明獲得CBF1基因。

關(guān)鍵詞：擬南芥 RNA 抗旱基因 CBF1

擬南芥（Arabidopsis thaliana）：十字花科，兩年生草本，高7厘米～40厘米，廣泛用于植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等研究，已成為一種典型的模式植物。其原因主要基于該植物具有以下特點(diǎn)：植株個(gè)體小（1平方厘米可種植好幾棵）、生長周期快（從發(fā)芽到開花不超過6周）、種子多（每株每代可產(chǎn)生數(shù)千粒種子）、生命力強(qiáng)（用普通培養(yǎng)基就可作人工培養(yǎng)），其基因組是目前已知植物基因組中最小的；同時(shí)，擬南芥屬于自花授粉植物，基因高度純合，用理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能缺陷型的植株。因此，其被科學(xué)家譽(yù)為“植物中的果蠅”。

1. CBF基因功能及特性

CBF轉(zhuǎn)錄激活因子是一類受低溫特異誘導(dǎo)的反式作用因子，它們能與CRT/DRE（C-repeat/dehydration-responsive element）DNA調(diào)控元件特異結(jié)合，促進(jìn)啟動子中含有這一調(diào)控元件的多個(gè)冷誘導(dǎo)和脫水誘導(dǎo)基因的表達(dá)，從而激活植物體內(nèi)的多種耐逆機(jī)制。擬南芥CBF1轉(zhuǎn)錄激活因子能調(diào)控一組抗干旱、抗低溫基因的表達(dá)，更有效地提高植物抗干旱、抗低溫的能力。對冷馴化過程中基因表達(dá)差異的認(rèn)識，使抗凍基因（COR）的克隆及其功能的分析成為研究冷馴化過程的主要目標(biāo)，在擬南芥和其他抗凍植物中分離出許多COR基因，這些基因?qū)χ参锟箖鲇蟹浅Ｖ匾淖饔谩Ｔ跀M南芥COR調(diào)控的研究中發(fā)現(xiàn)CBF轉(zhuǎn)錄因子的基因家族，其中CBF1能調(diào)控一組COR基因的表達(dá)。近年來，在冷敏植物如番茄和玉米中發(fā)現(xiàn)了CBF類似基因，擬南芥CBF1基因在轉(zhuǎn)基因番茄和小麥中的過量表達(dá)提高了植株的抗寒和抗旱性。這一研究結(jié)果展示了擬南芥CBF1類似基因的應(yīng)用可能為冷敏植物抗寒和抗旱性的品種改良提供一條新的途徑。

2.材料與方法

2.1材料

2.1.1菌株、植物材料和載體

擬南芥Columbia（At）、E.coli JM109為本實(shí)驗(yàn)室保存，pMD18-T Vector購于TaKaRa公司。

2.1.2主要試劑

樹脂型TM PCR產(chǎn)物純化試劑盒購于賽百盛公司。

Trizol試劑為Invotrigen公司產(chǎn)品，2×Pfu PCR MasterMix購于北京天為時(shí)代生物技術(shù)公司，DEPC為Sigma公司產(chǎn)品，MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T4-DNA連接酶為BioLab公司產(chǎn)品，其他常規(guī)試劑都購于各生物技術(shù)公司。

2.1.3緩沖液配制

焦炭酸二乙酯（DEPC）處理水：向蒸餾水中加入DEPC至終濃度為0.1%，攪拌至少12h，然后121℃滅菌30 min。

溶液Ⅰ：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml；高壓滅菌15分鐘，儲存于4℃冰箱。

溶液Ⅱ：0.1 mol/L NaOH，1%SDS。

溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml，過濾滅菌，保存在4℃。

2.2試驗(yàn)方法

2.2.1擬南芥總RNA的提取

用Trizol一步法提取擬南芥葉片的總RNA。為防止RNA的降解，提取RNA所用的器具均用0.1%DEPC室溫下浸泡12h以上，然后121℃高溫處理。

2.2.1.1取適量擬南芥葉片（經(jīng)液氮速凍后保存于超低溫冰箱）置于研缽內(nèi)，加液氮，研磨成粉末；

2.2.1.2取加有1ml Trizol試劑的1.5ml離心管，將50mg～100mg研磨好的樣品加入離心管，混勻，室溫放置5分鐘后，4℃，12000rpm/min離心5分鐘；

2.2.1.3將上清液轉(zhuǎn)入新離心管中，加200ul氯仿，振蕩混勻后，室溫放置15分鐘，4℃，12000g離心15分鐘；

2.2.1.4小心吸取上層水至另一離心管中，加0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置5分鐘～10分鐘。4℃，12000g離心10分鐘，棄上清，RNA沉于管底；

2.2.1.5加1ml 75%乙醇，溫和振蕩離心管。4℃，8000g離心5分鐘，盡量棄上清；

2.2.1.6室溫晾干或真空干燥5分鐘～10分鐘，用50μl無RNA酶水溶解RNA樣品，通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外吸收法確定總RNA的純度、濃度和完整性，立刻進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)或-80℃冰箱保存。

2.2.2反轉(zhuǎn)錄

輕輕混合，短暫離心，25℃保溫5min，42℃保溫60min，95℃處理5min，終止該反應(yīng)，離心10s～20s，將其放置在37℃下，加入1μL RNAase，輕輕混勻，37℃反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后，將樣品短暫離心，立刻進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)或-20℃冰箱保存。

2.2.3引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫查找擬南芥中的一個(gè)DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因CBF1，利用該cDNA基因序列設(shè)計(jì)引物CBF1up和CBF1down，從擬南芥cDNA中擴(kuò)增CBF1類轉(zhuǎn)錄因子基因。

CBF1up：5'-ATGAACTCATTTTCAGCTTTTTCTG-3'

CBF1down：5'- TTAGTAACTCCAAAGCGACACG -3'

2.2.4PCR片段的擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系20 L：2×Pfu PCR MasterMix 10μl，dNTP（10 mmol/L） 1μl，cDNA模板1μl，CBF1up （10μmol/L）和 CBF1down （10μmol/L）各1μl，ddH2O補(bǔ)至 20 L。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1.5min，30個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸10min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測（1%瓊脂糖，80V，20分鐘）。

2.2.5 DNA片段的回收

使用樹脂型TM PCR產(chǎn)物純化試劑盒（賽百盛公司） 回收PCR產(chǎn)物，具體操作過程參照使用說明書進(jìn)行。得到目的片段后，取4μl電泳（0.8%瓊脂糖，120V，10分鐘）檢測并定量測定。

2.2.6PCR片段與T載體的連接

配制A反應(yīng)混合物（使用前臨時(shí)配制）：回收PCR片段33μl，10×PCR Buffer 4μl，dNTP（10mmol/L） 2μl，Tag酶1μl，總體積為40μl；把加A反應(yīng)混合物72℃孵育10 min，加120μl無水乙醇和4μl乙酸鈉，混勻后-20℃沉淀20min，13000rpm離心15min。再用70%乙醇洗，13000rpm離心5min。沉淀真空干燥10min后用4.5μL無菌水溶解，用于與pMD18-T載體連接。

按照TaKaRa的pMD18-T Vector說明配制連接反應(yīng)混合物：DNA片段4.5μl，pMD18-T載體0.5μl，Solution I 5μl，總體積為10μl。把連接反應(yīng)混合物在16℃保溫12-16小時(shí)。然后加1μl乙酸鈉（1/10體積）和33μL無水乙醇（3倍體積），-20℃沉淀20min，13000rpm離心15min。再用70%乙醇洗，13000rpm離心5min。沉淀真空干燥10min后用5μL無菌水溶解。

2.2.7轉(zhuǎn)化

把Eppendorf管和電轉(zhuǎn)化杯預(yù)冷備用，于冰上凍融-70℃保存的感受態(tài)細(xì)胞，取2.5μL重組載體加入到40μL的感受態(tài)細(xì)胞中混勻，冰浴1min；將細(xì)胞和DNA混合液轉(zhuǎn)到電轉(zhuǎn)化杯中，并將液體敲至杯底。把小杯放入電轉(zhuǎn)儀的小盒中，電擊；取出小杯，迅速加入1mL LB培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞。把細(xì)胞轉(zhuǎn)至滅菌的離心管中，37℃輕柔振蕩1小時(shí)，取電擊轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液500μL，往離心管中加入40μl X-gal（20 mg/ml）和4μl IPTG（200 mg/ml），混勻后，涂平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

2.2.8鑒定轉(zhuǎn)化子

從平板上挑取半個(gè)白斑菌落，進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 2μL，dNTP（10 mmol/L） 1μL，CBF1up （10 μmol/L）和CBF1down（10 μmol/L）各1μl，Taq酶1μl，再挑入半個(gè)白斑菌落，用ddH2O補(bǔ)齊到20μL。

擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，32個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸10min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測（1%瓊脂糖，80V，20分鐘）。

2.2.9質(zhì)粒DNA的大量提取

2.2.9.1取一管-70℃保存的大腸桿菌（含已轉(zhuǎn)化目的片段的質(zhì)粒），接種50mL LB培養(yǎng)基（含100μg/mL Amp），37℃ 260r振蕩過夜。

2.2.9.2取過夜培養(yǎng)物，5000r，4℃離心3min。

2.2.9.3棄上清，倒置離心管于吸水紙上，吸去殘余的液體。

2.2.9.4用3mL溶液I重懸沉淀，在旋渦振蕩器上劇烈振蕩，使沉淀充分懸浮。

2.2.9.5加入6mL新鮮配制的溶液II，輕輕顛倒混勻，冰上放置3min。

2.2.9.6加入4.5mL溶液III，輕輕顛倒混勻，冰上放置5min。

2.2.9.713000r，4℃離心10min，移出上清，用擦鏡紙過濾。

2.2.9.8上清中加入0.6-1倍體積的異丙醇，冰上放置10min，13000r，4℃離心10min。

2.2.9.9棄上清，70%乙醇小心漂洗沉淀，稍離心后傾去乙醇，將沉淀于真空干燥器中干燥。

2.2.9.10在干燥后的離心管中，每管加入500mL TE，用槍把沉淀打散，移入Eppendorf管中，加入10μL RNase，37℃保溫15min。

2.2.9.11每管加入500μL Tris飽和酚，顛倒混勻，14000r離心3min。

2.2.9.12小心將上層水相移至另一無菌Eppendorf管中，加入500μL 酚∶氯仿，顛倒混勻，14000r離心2min。

2.2.9.13小心將上層水相移至另一無菌Eppendorf管中，加入500μL 氯仿，顛倒混勻，14000r離心15min。

2.2.9.14取上清，加入等體積13.3% PEG8000，冰上放置15min，14000r離心15min。

2.2.9.15棄上清，沉淀用500μL 70%乙醇小心漂洗（盡量不使沉淀漂起來），離心3min。棄去乙醇，沉淀于真空干燥器中干燥。

2.2.9.16用50μL無菌水或TE液溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆?，或酶切電泳檢測。

2.2.10雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和 Pst I雙酶切處理。酶切體系為：酶切緩沖液2.5μl，PCR產(chǎn)物或載體3.0μl，EcoR I（10U/μl） 1.0μl，Pst I（10U/μl） 1.0μl，無菌水17.5μl，總體積為25μl。37℃孵育1h，瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

3.結(jié)果與分析

3.1 RT-PCR擴(kuò)增CBF1基因

以總RNA為模板，通過MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的一鏈，再以此為模板，采用CBF1up和CBF1down為引物，擴(kuò)增激活蛋白cDNA基因，瓊脂糖凝膠電泳后，得到一條約1Kb大小的片斷，結(jié)果如圖1。

3.2擴(kuò)增片段與T載體連接

把片斷回收，加A后與pMD18-T載體連接后，重組質(zhì)粒命名為pT-CBF1，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后，挑取白色菌落，提取質(zhì)粒，根據(jù)T載體上的多克隆位點(diǎn)序列，選用EcoR I和 Pst I進(jìn)行酶切，瓊脂糖電泳，電泳結(jié)果如圖2：

3.3序列分析

分析序列并利用軟件DNAMAN翻譯相應(yīng)蛋白質(zhì)，得到該基因A、C、G、T數(shù)量分別是162、138、186、156，GC%為50.47%。

對翻譯所得的蛋白序列進(jìn)行分析，蛋白長度為213個(gè)氨基酸，分子量為23811.4，各氨基酸組成的分析見上表1。

4.總結(jié)與討論

本文根據(jù)Tran 等報(bào)道的擬南芥中CBF1基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增基因，并連接到克隆載體上，下一步進(jìn)行原核表達(dá)，利用表達(dá)產(chǎn)物制備多克隆抗體，用以確定高羊茅、狗牙根、結(jié)縷草和馬蹄金等抗旱性強(qiáng)的植物中是否含有DREB類轉(zhuǎn)錄因子，然后從所篩選的植物中獲得新的DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因，并對該基因進(jìn)行序列分析、功能預(yù)測及其表達(dá)研究，同時(shí)構(gòu)建DREB類基因的植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步利用DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行其他草坪草的遺傳轉(zhuǎn)化，為培育抗旱草坪草品種奠定基礎(chǔ)。

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