王昊楠　張培培　楊文健

摘 要： 將脂肪酶固定化，可以提高酶的專一性及穩(wěn)定性等，使酶的性質(zhì)更加穩(wěn)定，且反應條件溫和，副產(chǎn)物少，易于分離。本文綜述了常用的固定化方法，包括物理吸附法、共價交聯(lián)法和包埋法等，研究了不同的固定化方法對酶的性質(zhì)的影響。

關鍵詞： 脂肪酶 固定化 方法

脂肪酶（又稱甘油酯水解酶）是一類廣泛用于催化甘油三酯水解的酶類。除了具有水解的功能外，它還可以催化醇解、酯化、酯交換等反應，但在實際使用過程中，游離脂肪酶存在易失活、催化反應不穩(wěn)定、與產(chǎn)物分離困難或分離成本高等缺點[1]，因此限制了脂肪酶的進一步應用，然而通過選擇合適的載體及固定化方法，將脂肪酶固定化，可以有效解決上述問題。本文介紹了近幾年不同學者研究脂肪酶固定化的方法和研究成果，以期為固定化脂肪酶的生產(chǎn)及應用提供參考。

1.固定化脂肪酶的方法

1.1吸附法

吸附法通過氫鍵、疏水鍵、電子親和力等分子間作用力完成酶的固定[2]。吸附法具有工藝簡單、酶殘余活力高、載體材料豐富的特點。

王冰[3]等以沙蒿多糖-殼聚糖復合磁性微球為載體，采用物理吸附法固定化脂肪酶，對固定化過程中對酶活力有影響的各種因素進行研究，同時對固定化酶的部分理化性質(zhì)、最適IR、溫度、酶的熱穩(wěn)定性和表觀米氏常數(shù)等與游離酶做了比較。確定固定化脂肪酶的最佳條件為每 0.1g 載體加 2%（w/v）的酶溶液0.9 ml，固定8h，pH 8.4，溫度為50℃。

縱偉[4]等以磁性殼聚糖微球為載體，用物理吸附法固定化脂肪酶，對影響固定化的各種因素進行考察，確定固定化的最適宜條件為加酶量600 U/g，溫度5℃ ，pH 7.0，固定時間 2h，固定化酶連續(xù)使用5 次，其相對酶活仍為使用前的57.8% ，具有較好的操作穩(wěn)定性。

Liu等[5]采用吸附法將脂肪酶固定在經(jīng)四乙氧基硅烷修飾的磁性納米顆粒上，并用此催化橄欖油和甲醇制備生物柴油，發(fā)現(xiàn)在室溫條件下，當水質(zhì)量分數(shù)為10%、轉(zhuǎn)速為200rpm、醇油比4：1時，反應12h后生物柴油的產(chǎn)率可達70%。

Kuo等[6]以磁性殼聚糖微球為載體，N-羥基琥珀酰亞胺和碳二亞胺為交聯(lián)劑制備固定化脂肪酶，利用響應面優(yōu)化法對固定化條件進行優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)當固定化時間為2.14h，pH為6.37，酶與載體的質(zhì)量比為0.73時。固定化脂肪酶脂的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性均比游離酶有所提高，重復使用20次后，仍然保持83%的初始酶活力。

程娟[7]以脂肪酶為原料，通過單因素試驗對影響脂肪酶固定化的因素進行分析，并結合響應面方法確定最佳工藝條件為：硅烷化試劑添加量 0.35%，硅藻土與酶的質(zhì)量比 3.5：1，溫度 29 ℃和時間 4.5h，固定后的脂肪酶活力為206.67 U·g-1。

1.2包埋法

酶的包埋是將脂肪酶捕獲到聚合物內(nèi)部空隙或微囊中的方法。

李剛銳[8]利用溶膠-凝膠法固定脂肪酶，選用TMOS、MTMS、ETMS和PTMS 4 種硅烷試劑對黑曲霉脂肪酶進行了固定化研究。確定固定化的最佳配方為ETMS/TMOS = 5∶1，水與硅烷試劑分子比為8；最適反應 pH為pH 4.0， 固定化脂肪酶最適反應溫度為 60℃，較游離脂肪酶提高了 10℃；延長了固定化脂肪酶的使用壽命，提高了保存穩(wěn)定性，使用12次后仍能夠保留 71.7%活性。

虞鳳慧等[9]以海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉為復合載體，研究包埋法固定化畢赤酵母高溫堿性脂肪酶。通過單因素試驗考察了不同因子對脂肪酶固定化的影響，確定包埋法固定化脂肪酶的最優(yōu)條件為海藻酸鈉含量1.0%、羧甲基纖維素鈉含量0.25%、加酶量50 U/（g載體）、CaCl2濃度0.4 mol/L，固定化時間40 min。在此條件下，酶活回收率高達99.50%。

1.3共價鍵結合法

共價鍵結合法是先在載體上引進一個活潑基團，然后此活潑基團再與酶分子上的某一基團反應形成共價鍵的方法。

Xu 等[10]研究了將豬胰脂肪酶固定在氨基修飾的 SBA-15 上，結果表明氨基修飾的 SBA-15 固定化酶具有更好的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，重復使用五次后酶活性仍達到初始時的 49.2%。

Hu等[11]在 SBA-15上分別修飾三種不同的基團，形成 COOH-IL-SBA、CH3-IL-SBA、NH2-IL-SBA 載體對洋蔥假單胞菌脂肪酶的固定化進行研究。結果表明NH2-IL-SBA 固定化酶的水解活性最高，能達到 SBA-15 固定化酶活性的12.39 倍。

Yang等[12]制備了羧基功能化離子液體修飾的 SBA-15，用來固定豬胰脂肪酶。結果顯示，羧基功能化離子液體修飾的 SBA-15 對脂肪酶的固定化效率高達 95% 以上，遠高于相同條件下的傳統(tǒng) SBA-15 的酶固定化效率。

1.4其他方法

黃磊[13]等研究了泡沫陶瓷的孔徑分布和表面性質(zhì)對脂肪酶固定化的影響。泡沫陶瓷用硅烷偶聯(lián)劑對其進行表面改性處理后，成功地應用于脂肪酶的固定化。實驗結果表明，泡沫陶瓷的納米孔孔徑分布非常適合脂肪酶的固定化，對固定化酶的催化效率有決定性影響。

曲偉光等[14]以氯乙酰化聚苯乙烯微球載體為大分子引發(fā)劑，以甲基丙烯酸縮水甘油酯和親水性丙艦胺為共聚接枝單體，以氯化亞銅及2，2′-聯(lián)吡啶為催化體系，采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法合成了具有柔性鏈的親水梳狀環(huán)氧載體PS-acyl-P（AM-co-GMA），讓此固定化酶催化對硝基苯酚棕櫚酸酯的水解，連續(xù)進行7次間歇操作，仍保留初始活性的73.5%；于4℃保存60d，酶活剩余86.8%。經(jīng)親水梳狀環(huán)氧體載體柔性固定化后，該脂肪酶對有機溶劑的耐受性也比較好。

2.展望

以上綜述了吸附法、包埋法、共價鍵結合法固定化脂肪酶研究的新進展。吸附法操作簡單，載體種類豐富，但脂肪酶與載體的結合通過物理吸附，連接不緊密，容易脫落；包埋法一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基進行結合反應，很少改變酶的高級結構， 酶活回收率較高，可應用于許多酶、微生物和細胞器的固定化；共價鍵結合法與吸附法相比反應條件苛刻，操作復雜，會改變或破壞部分酶的活性中心，使活力回收率較低， 但是酶與載體結合較牢固，酶不易脫落，穩(wěn)定性好。如何克服單獨使用這些方法的缺點成為應用固定化酶的主要障礙。希望未來，隨著固定化技術的研究，載體材料選擇及改性方法的成熟，吸附法能夠更好地與包埋法、化學法等結合發(fā)展固定化脂肪酶技術，讓該項技術能夠更好更方便地應用于各個領域。

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