周靜

（中國(guó)人民解放軍68305部隊(duì)，甘肅 永登 730305）

流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用及研究進(jìn)展

周靜

（中國(guó)人民解放軍68305部隊(duì)，甘肅 永登 730305）

流式細(xì)胞術(shù)已從最初的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)發(fā)展成為臨床病理學(xué)家和免疫學(xué)家用于診斷、監(jiān)測(cè)腫瘤和免疫性疾病病人病情的常規(guī)工具。文章將對(duì)流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤、免疫性疾病、細(xì)胞治療和移植等方面的應(yīng)用進(jìn)展作綜述。

流式細(xì)胞術(shù)；臨床應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）就是讓細(xì)胞處于快速流動(dòng)中，然后對(duì)流動(dòng)中的細(xì)胞或生物粒子進(jìn)行分析或分選。它是集成了激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、流體力學(xué)、光電測(cè)量技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)等多項(xiàng)技術(shù)的一種生物分析技術(shù)。

1 流式細(xì)胞術(shù)和腫瘤的診斷、預(yù)后

惡性腫瘤的早期診斷是提高治愈和生存率的關(guān)鍵，但癌癥早期多缺乏客觀明確的診斷指標(biāo)，難以獲得形態(tài)學(xué)上的證據(jù)。流式細(xì)胞術(shù)可測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DNA含量的能力給腫瘤診斷帶來(lái)了極大的幫助。因?yàn)槿梭w正常細(xì)胞多是以二倍體形式存在，而癌變的細(xì)胞其DNA數(shù)量會(huì)發(fā)生變化，所以流式細(xì)胞術(shù)可為腫瘤生物學(xué)行為的判斷提供重要依據(jù)，有助于癌變的早期診斷。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)標(biāo)本可為實(shí)體瘤標(biāo)本、穿刺標(biāo)本、胸腹水標(biāo)本、尿液、胃鏡、支氣管鏡鉗取的活檢標(biāo)本等，首先將實(shí)體瘤組織解聚、分散制備成單細(xì)胞懸液，用熒光染料染色后對(duì)細(xì)胞的DNA含量進(jìn)行分析，最后將不易區(qū)分的群體細(xì)胞分成三個(gè)亞群 （G0/GI期、S期、G2期），DNA含量直接代表細(xì)胞的倍體狀態(tài)，非倍體細(xì)胞與腫瘤惡性程度有關(guān)，DNA非整倍體細(xì)胞峰的出現(xiàn)即為癌變的重要標(biāo)志［1］。

越來(lái)越多的研究表明流式細(xì)胞術(shù)在血液系統(tǒng)惡性病變的預(yù)后評(píng)估及疾病監(jiān)測(cè)，腫瘤病人的免疫狀態(tài)評(píng)價(jià)等方面有重要作用［2-3］。若僅依靠形態(tài)學(xué)診斷淋巴造血系統(tǒng)腫瘤，僅有一小部分明顯的腫瘤如霍奇金淋巴瘤被確診，目前淋巴造血系統(tǒng)腫瘤的分類綜合了形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等指標(biāo)［4］，診斷更加準(zhǔn)確。流式細(xì)胞術(shù)分析可以得出惡性病變細(xì)胞的免疫表型、細(xì)胞的DNA含量，這可以用來(lái)選擇特異的治療，并為疾病的診斷、預(yù)后提供重要信息。比如，不同的CD20陽(yáng)性B細(xì)胞惡性病變目前通常使用抗CD20單抗治療，一小部分CD52陽(yáng)性的T細(xì)胞核B細(xì)胞惡性病變可使用抗CD52單抗治療。流式細(xì)胞術(shù)可用來(lái)區(qū)分套細(xì)胞淋巴瘤和與之形態(tài)相似的其它CD20陽(yáng)性B細(xì)胞淋巴瘤［5］。因?yàn)檫@些B細(xì)胞腫瘤的抗原表達(dá)譜各有不同，因此流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)確定腫瘤細(xì)胞的抗原表達(dá)譜及相對(duì)的抗原表達(dá)量可促進(jìn)疾病的診斷。流式細(xì)胞術(shù)還具有在混合細(xì)胞中檢測(cè)少量特定細(xì)胞的能力，這可以用于評(píng)估腫瘤治療后的殘存惡性細(xì)胞，通常來(lái)說(shuō)若治療后仍存在惡性細(xì)胞提示較差的預(yù)后。流式細(xì)胞術(shù)還可快速檢測(cè)細(xì)胞中DNA的相對(duì)含量，這可用于急性淋巴細(xì)胞白血病的治療指導(dǎo)。

2 流式細(xì)胞術(shù)和免疫性疾病

T、B和NK淋巴細(xì)胞的水平是監(jiān)測(cè)機(jī)體的免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)。通過(guò)表面標(biāo)志物監(jiān)測(cè)各免疫細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞因子水平，以及對(duì)淋巴細(xì)胞各亞群數(shù)量的測(cè)定可了解患者的免疫狀態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)與單克隆抗體結(jié)合，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原、癌基因及膜受體的定量檢測(cè)取得了很大的進(jìn)展。其原理主要是：利用抗原抗體特異性反應(yīng)，先將不同單克隆抗體帶上各種熒光染料作為熒光探針，這種熒光探針與單克隆抗體結(jié)合緊密。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)激光器發(fā)射的激光照射后，細(xì)胞膜的抗原抗體復(fù)合物上的熒光探針就可以發(fā)射出不同光譜的繼發(fā)熒光，帶熒光探針的單克隆抗體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原的結(jié)合的繼發(fā)熒光量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，這就代表了細(xì)胞表面的抗原量。這些熒光通過(guò)流式細(xì)胞儀的識(shí)別和分辨，便可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞表面抗原的定量檢測(cè)。

流式細(xì)胞術(shù)可用于HIV感染后CD4陽(yáng)性T細(xì)胞的計(jì)數(shù)［6］，以及多種原發(fā)性免疫缺陷病，如自發(fā)免疫性淋巴組織增生綜合征、多發(fā)免疫缺陷、抗體缺陷病的分類和預(yù)后評(píng)估。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)同種異體干細(xì)胞移植或同種異體骨髓移植后病人特定免疫細(xì)胞的定量對(duì)病人移植后的生存分析有重要作用。

3 流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞治療、移植

流式細(xì)胞術(shù)可分選特定的細(xì)胞群，然后用于細(xì)胞治療。CD34陽(yáng)性是人造血干細(xì)胞的標(biāo)志之一，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)可分離、提純CD34陽(yáng)性細(xì)胞以供細(xì)胞移植治療。自體CD34陽(yáng)性細(xì)胞移植治療大大地減少了以往移植過(guò)程中可能的腫瘤細(xì)胞的混入，降低了疾病再?gòu)?fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。已有文獻(xiàn)報(bào)道采用分選、純化的CD34陽(yáng)性干細(xì)胞治療乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤，結(jié)果表明治療后可形成持久的造血重建［7-9］，但是由于研究樣本量較少且缺乏對(duì)照，因此其有效性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用還包括在輸血后、移植前、孕期、移植前HLA型別判定時(shí)檢測(cè)人類白細(xì)胞抗原（HLA）的抗體。20世紀(jì)80年代有研究［10］報(bào)道若流式細(xì)胞術(shù)可檢測(cè)到移植捐贈(zèng)者的HLA抗體，發(fā)生早期移植物抗宿主反應(yīng)可能較大。之后，大量研究證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)不僅適用于腎移植，也適用于其他實(shí)體器官移植。在血液系統(tǒng)疾病中，明確地檢測(cè)到針對(duì)HLA抗原的HLA抗體也提示移植失敗。因此，多數(shù)情況下，捐贈(zèng)者HLA抗體的測(cè)出是移植禁忌癥。

基于微粒技術(shù)來(lái)檢測(cè)HLA抗體的新方法極大地促進(jìn)了流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用，這種技術(shù)顯著地降低了以往方法的假陽(yáng)性。新近，還出現(xiàn)了基于多路技術(shù)平臺(tái)的新型流式細(xì)胞術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)100種獨(dú)特的雙色熒光微粒。在微粒上連接特異性DNA探針后，這種多路流式細(xì)胞術(shù)還可用于檢測(cè)HLA基因型別，最多可同時(shí)檢測(cè)100個(gè)HLA等位基因。因此，現(xiàn)在只需一臺(tái)流式細(xì)胞儀就可開(kāi)展高通量的HLA型別分析。這項(xiàng)技術(shù)在檢測(cè)干細(xì)胞或器官移植病人的HLA分子間的單氨基酸序列差異上也有較高的敏感性和特異性。

4 結(jié)語(yǔ)

流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用對(duì)疾病的診斷、分類，腫瘤病人及同種異體干細(xì)胞移植、器官移植病人的監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)估都有重要作用。流式細(xì)胞術(shù)產(chǎn)生的高通量數(shù)據(jù)應(yīng)該得到很好的利用，這需要生物信息學(xué)的大力推動(dòng)。

［1］ 張韞，楊鑫，李忻.流式細(xì)胞術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用［J］.中日友好醫(yī)院學(xué)報(bào)，2012，26（5）：303-306.

［2］ Zhou，Y.M.Othus，etal.Pre-andpost-transplant quantificationofmeasurable（'minimal'）residualdiseasevia multiparameter flow cytometry in adult acute myeloid leukemia［J］.Leukemia，2016，2.2

［3］ Wang，Y.L.Peng，et al.Clinical value to quantitate hematogones in Chinese childhood acute lymphoblastic leukemiabyflowcytometryanalysis［J］.Internationaljournal oflaboratoryhematology，2016.

［4］ Swerdlow（2008）.WHOclassificationoftumoursofhaematopoietic andlymphoidtissues，WorldHealthOrganization.

［5］ Wang，W.L.Gao，et al.The application of CD73 in minimal residual disease monitoring using flow cytometry in B-cell acute lymphoblastic leukemia［J］.Leukemia&lymphoma，2015，1-8.

［6］ Wang，L.H.Degheidy，et al.Quantitative Flow Cytometry MeasurementsinAntibodiesBoundperCellBasedonaCD4 Reference［J］.Currentprotocolsincytometry，2016，75，21-22.

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