譚剴心鄒俁希

重慶地區(qū)特異性分枝桿菌噬菌體的分離與裂解肽效能研究

譚剴心鄒俁希

分離新的分枝桿菌噬菌體，研究其生物學(xué)特性，以及裂解酶，將有助于控制分枝桿菌在環(huán)境中的傳播，豐富對噬菌體多樣性的認(rèn)識。噬菌體的裂解性肽段可以與其他化合物分子耦合，成為雙功能分子，如與抗瘧疾的青蒿素結(jié)合，可同時(shí)殺滅分枝桿菌和瘧原蟲。

實(shí)驗(yàn)方法

噬菌體分離純化。分別取5份土樣10g，加入15ml MP buffer、30μl Amp（50mg/ml）和1ml 新鮮培養(yǎng)的恥垢分枝桿菌懸濁液，混勻。于37℃，160r/min培養(yǎng)過夜。

分別取三份污水樣品300μl，加入新鮮培養(yǎng)的恥垢分枝桿菌宿主菌懸液1mL，LB液體培養(yǎng)基35ml， MP buffer15ml，Amp（50mg/ml）30μl加 CaCl2至終濃度1mmol/L，置37℃，160r/min培養(yǎng)過夜。

取培養(yǎng)過夜樣品12000r/min離心6min，取上清用0.22μm過濾器過濾除菌。將濾液進(jìn)行倍比稀釋。取1ml恥垢分枝桿菌懸濁液，與3ml濾液混合靜置15min。取2ml宿主菌-噬菌體懸液，再加入4ml水瓊脂（ 0.7%的瓊脂,1mM CaCl2），加入Middlebrook的7H10/ Amp平板上，37℃培養(yǎng)過夜。觀察噬菌斑形成情況。噬菌斑形成時(shí)，挑取透明單個(gè)噬菌斑接種至宿主菌培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)3～5次反復(fù)純化后得形狀大小一致的噬菌斑。

噬菌體一步生長曲線。培養(yǎng)200ml恥垢分枝桿菌（含20%Tween80）至OD600達(dá)到0.6～0.8。用新鮮7H9

培養(yǎng)基（無Tween80）洗菌體3遍，去除Tween80。在菌液中加入噬菌體，使其MOI達(dá)到10?；靹蚝螅?7℃溫育30min。13000 r/min離心30s，取上清，用MP buffer重懸，置于37℃搖床，110r/min震蕩培養(yǎng)。從40min起每隔45min取樣50ul，13000 r/min離心30s。取上清，倍比稀釋后用雙層平板法測定噬菌體滴度。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，繪制一步生長曲線。

噬菌體裂解效能實(shí)驗(yàn)。采用平板法測定污水中總菌數(shù)。分別取一份污水樣品10ml，13000r/min離心5min，加入噬菌體懸液1ml，混合5min后倍比稀釋8倍，取不同稀釋度的混合液1ml，涂布于7H9固體平板陪養(yǎng)過夜，計(jì)算總菌數(shù)。做3個(gè)平行。

分枝桿菌噬菌體SWU1 lysin基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。選取西南大學(xué)已完成測序工作的分枝桿菌噬菌體SWU1，學(xué)習(xí)裂解基因的親緣關(guān)系比對方法及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。登陸NCBI，用Blast軟件將lysin裂解基因序列與GenBank中已有的序列進(jìn)行比對，用MEGA6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

結(jié)果與討論

分枝桿菌噬菌體分離。分離到一種噬菌體ZT，噬菌斑的大小。

噬菌體ZT一步生長曲線。將約2×103PFU/mL的噬菌體與約2×102cfu/ mL的宿主菌混合培養(yǎng)，從40min開始取樣，稀釋9個(gè)梯度涂板。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以噬菌體滴度為縱坐標(biāo)作噬菌體ZT的一步生長曲線圖(圖1)，噬菌體ZT感染宿主菌的潛伏期為220 min 左右，爆發(fā)時(shí)間為180 min 左右，爆發(fā)量為4.5×103（噬菌體終滴度9×103PFU/mL）/（菌液初始濃度2×102cfu/mL）。

分枝桿菌噬菌體ZT裂解效能實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)可看到噬菌體對三個(gè)平行污水樣品中的菌體，都有明顯得裂解效果，菌株數(shù)目均有大幅減少。

lysin基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析。在GenBank中選取比對出與分枝桿菌噬菌體Mycobacteriophage SWU1的lysinA 基因序列相似度較高的18種噬菌體基因序列，選取與分支桿菌噬菌體Mycobacteriophage SWU1的lysinB 基因序列相似度較高的20種噬菌體基因序列。從分枝桿菌噬菌體SWU1 Lysin A基因的系統(tǒng)發(fā)育樹以及分枝桿菌噬菌體SWU1 Lysin B基因的系統(tǒng)發(fā)育樹可看出Mycobacteriophage SWU1 Lysin A基因與Mycobacterium phage Chy4,Mycobacterium phage Chy5的同源性達(dá)到了98%，Mycobacteriophage SWU1 Lysin B基因與Mycobacterium phage Chy4的同源性達(dá)99%，可以推測Mycobacteriophage SWU1與Mycobacterium phage Chy4有較近的親緣關(guān)系。

應(yīng)用實(shí)踐及展望

本項(xiàng)目成功從重慶地區(qū)環(huán)境污水中分離得到一種分枝桿菌噬菌體，對其生理特性及分枝桿菌的主要裂解基因lysin基因的親緣關(guān)系進(jìn)行了研究，為尋找具有地區(qū)特異性的分枝桿菌噬菌體，探究噬菌體之間的親緣關(guān)系以及其與宿主菌之間的作用機(jī)制提供線索。還可以利用噬菌體的高效裂解性和專一性，治理污水中分枝桿菌造成的環(huán)境污染。并將在后續(xù)試驗(yàn)中將噬菌體的裂解性肽段與其他化合物分子耦合，成為雙功能分子，開發(fā)噬菌體的綜合效能。

由于實(shí)驗(yàn)的偶然性和時(shí)間關(guān)系，裂解肽的工作正在進(jìn)行中。在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，預(yù)期我們的下一階段工作會(huì)開創(chuàng)一個(gè)嶄新的領(lǐng)域。

（作者單位：西南大學(xué)附屬中學(xué)校；指導(dǎo)教師： 宋潔）