馮雅麗 李洪珊 李浩然

(1.北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083；2.中國科學(xué)院過程工程研究所生化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100080)

一株深海反硝化菌的分離鑒定及反硝化特性研究*

馮雅麗1李洪珊1李浩然2#

(1.北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083；2.中國科學(xué)院過程工程研究所生化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100080)

從深海沉積物中分離獲得一株具有較高脫氮效率的反硝化菌YL-1，通過形態(tài)觀察、生理生化特性及16S rDNA同源性分析，確定該菌株為蒙氏假單胞菌(Pseudomonasmonteilii)?？疾炝薈、N質(zhì)量比(C/N)、碳源、初始pH、溫度及鹽度對其反硝化作用的影響。結(jié)果表明：菌株YL-1反硝化最佳條件為最適碳源為乙酸鈉、C/N不低于6∶1、初始pH為7.0～9.0、溫度為25～35 ℃；該菌株具有較強(qiáng)的反硝化性能，鹽度在100 g/L以內(nèi)時(shí)對其反硝化特性影響不大。

反硝化菌 蒙氏假單胞菌(Pseudomonasmonteilii) 16S rDNA 硝酸鹽氮

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的高速發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，生活污水和企業(yè)工業(yè)廢水直接排入水體，水體質(zhì)量急劇惡化[1]。對于氮素污染的治理，國內(nèi)外常見的工程技術(shù)有選擇性離子交換法、空氣吹脫法、折點(diǎn)加氯法、磷酸氨鎂沉淀法及生物脫氮法等[2]。其中，生物脫氮以其無污染、脫氮徹底和安全等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是目前較經(jīng)濟(jì)、有效、可行性高的治理技術(shù)[3]。生物反硝化即利用反硝化菌的作用，將硝酸鹽氮(亞硝酸鹽氮)轉(zhuǎn)化為氣態(tài)產(chǎn)物脫除，被認(rèn)為是較經(jīng)濟(jì)有效的脫氮方式[4-5]。

本研究選用具有特殊生態(tài)環(huán)境的太平洋海底表面沉積物為菌種分離來源，通過富集、分離等步驟，得到一株具有較強(qiáng)反硝化能力的菌株，對其進(jìn)行鑒定，并在實(shí)驗(yàn)室條件下研究了該菌株的反硝化特性，旨在為生物脫氮技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用提供有效菌源和技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

實(shí)驗(yàn)樣品來自中國大洋生物樣品館保藏的太平洋海底表面沉積物。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基[6]：胰化蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10.0 g/L，pH=7.0，121 ℃滅菌20 min。

分離培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)基中加入15～20 g/L瓊脂。

硝酸鹽培養(yǎng)基：KCl 0.13 g/L、NaH2PO43.31 g/L、Na2HPO410.31 g/L、NaCl 2.9 g/L、KNO30.721 8 g/L。該培養(yǎng)基中硝酸鹽氮為100 mg/L，碳源種類及濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行調(diào)整。

1.3 菌株分離及純化

在富集培養(yǎng)基中接種海底表面沉積物，放置30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3～5 d后，用接種環(huán)蘸取菌懸液至分離培養(yǎng)基上劃線，30 ℃培養(yǎng)，至平板長出明顯菌落。挑取分離平板上菌株單菌落，獲得分離菌株，多次在分離培養(yǎng)基上劃線，30 ℃培養(yǎng)，至顯微鏡下觀察無其他雜菌即得到純化菌株。將單菌落接種于硝酸鹽培養(yǎng)基，測定其反硝化能力，并選擇反硝化能力強(qiáng)的菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1.4 菌株鑒定

對菌株進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化特性鑒定以及16S rDNA序列測定。16S rDNA擴(kuò)增引物分別為：上游引物為27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)；下游引物為1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。

1.5 反硝化條件的優(yōu)化

將5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于裝有高溫滅菌的硝酸鹽培養(yǎng)基的錐形瓶中，錐形瓶用橡膠塞封口后30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔8 h取樣測定硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮含量。為優(yōu)化菌株的反硝化條件，共設(shè)5組實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)。(1)碳源選擇實(shí)驗(yàn)：分別以乙酸鈉、葡萄糖、酒石酸鉀鈉、淀粉和蛋白胨作為唯一碳源，C、N質(zhì)量比(C/N)為8∶1，初始pH為7.0，溫度為30 ℃，鹽度(以NaCl調(diào)節(jié)，下同)為50 g/L；(2)C/N影響實(shí)驗(yàn)：控制C/N分別為2∶1～10∶1，乙酸鈉為碳源，初始pH為7.0，溫度為30 ℃，鹽度為50 g/L；(3)初始pH影響實(shí)驗(yàn)：分別設(shè)置初始pH為5.0～9.0，乙酸鈉為碳源，C/N為6∶1，溫度為30 ℃，鹽度為50 g/L；(4)溫度影響實(shí)驗(yàn)：分別設(shè)置搖床溫度為20～40 ℃，乙酸鈉為碳源，初始pH為7.0，C/N為6∶1，鹽度為50 g/L；(5)鹽度影響實(shí)驗(yàn)：鹽度分別為50～200 g/L，乙酸鈉為碳源，初始pH為7.0，C/N為6∶1，溫度為30 ℃。

1.6 主要分析方法

硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮濃度測定分別采用紫外分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺光度法[7]。

2 結(jié)果和分析

2.1 菌株分離與鑒定

通過初步測定各菌株對硝酸鹽氮的降解情況，篩選出硝酸鹽氮去除率最高的一株作為實(shí)驗(yàn)對象，編號為YL-1。如圖1所示，菌株YL-1在分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，菌落呈圓形，表面光滑，濕潤黏稠，菌落呈白色。經(jīng)測定，菌株YL-1為革蘭氏陰性，葡萄糖反應(yīng)為陽性，能運(yùn)動(dòng)，16S rDNA序列結(jié)果表明該菌株與蒙氏假單胞菌(Pseudomonasmonteilii)相似性為99%，兩者在種水平上具有同源性。結(jié)合菌株形態(tài)及生理生化特性[8]，可基本確定菌株YL-1為蒙氏假單胞菌。

圖1 菌株YL-1菌落形態(tài)Fig.1 The colony morphology of strain YL-1

2.2 反硝化特性研究

實(shí)驗(yàn)中，亞硝酸鹽氮測試結(jié)果均在0.002 5 mg/L以下，可忽略不計(jì)，因此不再討論分析。

2.2.1 碳源對菌株YL-1反硝化反應(yīng)的影響

反硝化過程中硝酸鹽還原的電子供體及細(xì)胞生長都需要有機(jī)碳源來提供[9]。由圖2可見，40 h時(shí)，乙酸鈉為碳源時(shí)硝酸鹽氮濃度最低，葡萄糖次之，酒石酸鉀鈉和蛋白胨基本不能被菌株利用參與反硝化反應(yīng)。有研究表明，乙酸鈉屬于低分子簡單化合物，易被微生物利用，降解過程相對簡單[10]。因此，宜采用乙酸鈉作為菌株YL-1反硝化反應(yīng)的碳源。

圖2 不同碳源條件對菌株YL-1反硝化特性的影響Fig.2 Effects of carbon sources on strain YL-1 denitrification characteristics

2.2.2 C/N對菌株YL-1反硝化反應(yīng)的影響

由圖3可以看出，當(dāng)C/N為2∶1和4∶1時(shí)，菌株YL-1對硝酸鹽氮的脫除不理想；當(dāng)C/N為6∶1及以上時(shí)，菌株YL-1對硝酸鹽氮的降解基本保持不變，這是由于隨著C/N升高，充足的碳源可滿足菌體生長和反硝化的能量需求，反硝化活性也處于穩(wěn)定階段[11]。因此，從節(jié)約成本的角度考慮，C/N宜為6∶1。

圖3 不同C/N對菌株YL-1反硝化特性的影響Fig.3 Effects of C/N on strain YL-1 denitrification characteristics

2.2.3 初始pH對菌株YL-1反硝化反應(yīng)的影響

如圖4所示，初始pH在7.0以上時(shí)硝酸鹽氮濃度降解相近，初始pH為6.0時(shí)反硝化反應(yīng)情況不佳，初始pH為5.0時(shí)短時(shí)間內(nèi)基本不發(fā)生反硝化反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)后階段菌株YL-1對硝酸鹽氮的去除量減少主要是由于碳源不足引起。張苗等[12]對螯臺球菌屬(Chelatococcussp.)的研究表明，pH為7.0～9.0時(shí)適于細(xì)菌生長，反硝化活性穩(wěn)定。ZHANG等[13]和HIATT等[14]的研究表明，pH為中性或弱堿性時(shí)，細(xì)菌生長和反硝化酶活性達(dá)到最佳，pH過酸或過堿都會(huì)影響細(xì)菌生長及反硝化活性。以上結(jié)論與本研究結(jié)果一致。由此可知，初始pH為7.0～9.0時(shí)該菌能發(fā)揮最佳的反硝化能力。

2.2.4 溫度對菌株YL-1反硝化反應(yīng)的影響

由圖5可以看出，當(dāng)溫度為25～35 ℃時(shí)，反硝化反應(yīng)對硝酸鹽氮的去除量較高；低于25 ℃或高于35 ℃時(shí)均會(huì)不同程度地抑制菌株YL-1對硝酸鹽氮的降解。這是由于，溫度是影響細(xì)菌生長及反硝化酶活性的一個(gè)重要因素[15-16]?？梢姡?5～35 ℃為菌株YL-1反硝化反應(yīng)的最佳溫度范圍。

圖5 溫度對菌株YL-1反硝化特性的影響Fig.5 Effects of temperature on strain YL-1 denitrification characteristics

2.2.5 鹽度對菌株YL-1反硝化反應(yīng)的影響

由圖6可以看出，菌株YL-1有一定的耐鹽性，當(dāng)鹽度控制在100 g/L以下時(shí)，硝酸鹽氮濃度降解相近；高于100 g/L時(shí)隨著鹽度的增大，菌株YL-1對硝酸鹽氮降解的抑制程度增大。由此可見，菌株YL-1分離自深海沉積物，鹽度在100 g/L內(nèi)時(shí)對其反硝化特性影響不大，該菌株可利用的鹽度范圍較廣，適用于不同鹽度水平的自然水體的氮素去除，應(yīng)用前景廣闊。

圖6 鹽度對菌株YL-1反硝化特性的影響Fig.6 Effects of salinity on strain YL-1 denitrification characteristics

3 結(jié) 論

(1) 通過富集、分離及硝酸鹽培養(yǎng)基分離篩選，從深海沉積物中篩得一株脫氮性能較好的菌株YL-1。對菌株進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化特性鑒定及16S rDNA序列測定，可確定菌株YL-1為蒙氏假單胞菌。

(2) 菌株YL-1反硝化最佳條件：最適碳源為乙酸鈉，C/N不低于6∶1，初始pH為7.0～9.0，溫度為25～35 ℃。該菌株具有較強(qiáng)的反硝化性能，鹽度在100 g/L以內(nèi)時(shí)對其反硝化特性影響不大，反硝化的適宜條件范圍較廣。因此，該菌株具有進(jìn)一步研究及應(yīng)用的價(jià)值。

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Identificationanddenitrificationcharacteristicsofadeepseadenitrifier

FENGYali1，LIHongshan1，LIHaoran2.

(1.CivilandEnvironmentalEngineeringSchool，UniversityofScienceandTechnologyBeijing，Beijing100083；2.StateKeyLaboratoryofBiochemicalEngineering，InstituteofProcessEngineering，ChineseAcademyofScience，Beijing100080)

A denitrifying bacteria YL-1 was isolated from the deep-sea sediments which showed a high nitrogen removal efficiency. YL-1 was finally determined asPseudomonasmonteiliithrough morphological，physiological and biochemical characteristics，and 16S rDNA homology analysis. The effects of carbon source，C/N mass ratio，initial pH value，temperature and salinity on its denitrification characteristics was carried out. The optimum conditions of denitrification for strain YL-1 were as follow: the optimal carbon source was sodium acetate,the ratio of C/N was not less than 6∶1,the initial pH was 7.0-9.0 and the temperature was 25-35 ℃. YL-1 had perfect denitrification performance,the salinity of 100 g/L or less had little effect on its denitrification characteristics.

denitrifiers;Pseudomonasmonteilii; 16S rDNA; nitrate nitrogen

馮雅麗，女，1967年生，博士，教授，主要從事礦物微生物技術(shù)方面的研究工作。#

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*國家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(No.2015ZX07205-003)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.21176026、No.21176242)；中國大洋礦產(chǎn)資源研究計(jì)劃(No.DY125-15-T-08)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2016.12.006

編輯:黃 葦 (

2015-07-02)