張職視，林 輝，王麗芬，陳桂珍，賴(lài)淑芳，詹森然，李佳歡，孫淑靜，，胡開(kāi)輝，**

（1．福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2．福建農(nóng)林大學(xué) （古田）菌業(yè)研究院，福建 古田 352200）

斑玉蕈培養(yǎng)過(guò)程中酶活性與菌包成熟度的關(guān)系*

張職視1，林 輝2，王麗芬2，陳桂珍2，賴(lài)淑芳1，詹森然1，李佳歡1，孫淑靜1，2，胡開(kāi)輝1，2**

（1．福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2．福建農(nóng)林大學(xué) （古田）菌業(yè)研究院，福建 古田 352200）

為建立科學(xué)可靠的判斷斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）菌包成熟度的生物學(xué)參數(shù)評(píng)價(jià)指標(biāo)，為工廠化生產(chǎn)菌包成熟度的判斷提供科學(xué)依據(jù)。分別通過(guò)3，5-二硝基水楊酸法、碘試液比色法、福林酚法、2，2-聯(lián)氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽法、愈創(chuàng)木酚法分析斑玉蕈菌包不同培養(yǎng)時(shí)間其羧甲基纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶、中性蛋白酶、漆酶和錳過(guò)氧化物酶活性變化，以及培養(yǎng)時(shí)間與出菇產(chǎn)量之間的關(guān)系。結(jié)果表明，菌包培養(yǎng)溫度在21℃～25℃，培養(yǎng)時(shí)間120 d左右，菌包上、中、下各部木聚糖酶活力趨于13．7 U·mL-1；在70 d菌包上部漆酶活力達(dá)到最高值，在100 d中部與下部漆酶活力達(dá)到最大值；在120 d各部分漆酶活力趨于173．5 U·L-1，纖維素酶活力達(dá)6 U·mL-1～8 U·mL-1，淀粉酶活力保持在20 U·mL-1左右，中性蛋白酶活力4 U·mL-1左右，下部錳過(guò)氧化物酶活力達(dá)40 U·mL-1時(shí)，此階段出菇的產(chǎn)量最高達(dá)461．7 g·袋-1。

斑玉蕈；酶活力；生物學(xué)效率

斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus） 是近年來(lái)福建省工廠化生產(chǎn)的重要品種之一。菌包成熟度是斑玉蕈栽培過(guò)程中的關(guān)鍵影響因子之一。目前國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在其生物學(xué)特性[1]、遺傳育種[2-3]、子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生理活性物質(zhì)[4]、原材料的開(kāi)發(fā)與栽培特性[5-9]、酶活性和蛋白質(zhì)組[10-11]等方面，對(duì)栽培過(guò)程中菌包成熟度的判斷指標(biāo)缺乏系統(tǒng)研究。由于斑玉蕈是一個(gè)低溫結(jié)實(shí)性品種，在栽培生產(chǎn)中發(fā)菌較為緩慢，后熟培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，生產(chǎn)周期長(zhǎng)達(dá)120 d～150 d以上[12]。發(fā)菌時(shí)間長(zhǎng)短取決于菌包成熟度，菌包不夠成熟會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量低下甚至不出菇，造成產(chǎn)量不穩(wěn)定，商品價(jià)值低；而菌包過(guò)于成熟，又造成栽培周期過(guò)長(zhǎng)，加大企業(yè)的生產(chǎn)成本。目前國(guó)內(nèi)工廠化生產(chǎn)斑玉蕈過(guò)程中，對(duì)菌包成熟度的判斷主要憑借生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，缺乏有效的判斷依據(jù)，以致工廠化生產(chǎn)出菇不整齊，穩(wěn)定性差。因此，有學(xué)者曾經(jīng)對(duì)不同栽培時(shí)間的瓶裝斑玉蕈失重和含水量與出菇產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)系進(jìn)行了研究[13-14]，但未見(jiàn)利用酶活性進(jìn)行成熟度判定的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)觀察不同培養(yǎng)時(shí)間斑玉蕈菌包的生物學(xué)參數(shù)，研究培養(yǎng)時(shí)間對(duì)斑玉蕈現(xiàn)蕾、出菇速度、子實(shí)體品質(zhì)和產(chǎn)量的影響，以期為建立科學(xué)地判斷菌包成熟度的方法提供參考，為設(shè)定斑玉蕈標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的栽培參數(shù)提供有力的證據(jù)，為工廠化生產(chǎn)中穩(wěn)定產(chǎn)量發(fā)揮指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

斑玉蕈（閩真2號(hào))，為福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.2 菌包制作方法

生產(chǎn)菌包配方：棉籽殼48%、木屑10%、甘蔗渣10%、麩皮20%、玉米粉5%、豆粕5%、石灰2%，含水量63%，每袋裝干料500 g，121℃滅菌2 h。

1.3 不同成熟度斑玉蕈菌包出菇及生物學(xué)參數(shù)測(cè)定

將菌種接入菌包，置于25℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為60 d、70 d、80 d、90 d、100 d、110 d、120 d、130 d和140 d，每個(gè)處理設(shè)置8袋，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。然后搔菌，出菇，定時(shí)觀察菌袋出菇情況，記錄菌絲恢復(fù)料面泛白時(shí)間、原基形成時(shí)間，采收時(shí)間、出菇產(chǎn)量以及品質(zhì)。

出菇管理分4個(gè)階段：16℃～19℃，濕度95%～98%，無(wú)光照，不通風(fēng)3 d；13℃～16℃，濕度90%～95%，CO2濃度控制在2 700 μL·L-1，每2 h光照2 min至原基形成，時(shí)間約7 d；13℃～16℃，濕度90%～95%，CO2濃度控制在2 400 μL·L-1，無(wú)光照，培養(yǎng)至菌柄長(zhǎng)2 cm～4 cm，菌蓋2 mm～4 mm，時(shí)間約7 d；2℃～15℃，濕度90%～95%，CO2濃度控制在7 000 μL·L-1，無(wú)光照，培養(yǎng)至采收，時(shí)間約10 d，整個(gè)出菇時(shí)間約27 d。

1.4 斑玉蕈菌包酶活力測(cè)定

1．4．1 酶液提取方法

取每個(gè)階段的菌包3袋，每個(gè)菌包分為上、中、下三部分，每部分培養(yǎng)料用手充分揉碎混勻，稱(chēng)取10 g于50 mL燒杯中，加40 mL蒸餾水，25℃，150 r·min-1震蕩2 h，過(guò)濾，取濾液于50 mL離心管，9 000 r·min-1離心15 min，上清液即為粗酶液。

1．4．2 羧甲基纖維素酶活力測(cè)定

在試管中加入1 mL 1%CMC-Na溶液，再往試管中加入0．5 mL粗酶液，50℃保溫30 min。在試管中加入1．5 mL DNS試劑，再沸水浴7 min，然后用冷流水冷卻終止反應(yīng)。用蒸餾水定容至10 mL，充分混勻。用滅活酶液作空白對(duì)照。在520 nm處測(cè)吸光度。酶活力單位的定義為：在50℃、pH4．6的條件下，每分鐘水解底物生成1 μg葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位“U”[15]。

1．4．3 木聚糖酶活力測(cè)定

吸取1%木聚糖750 μL到試管中，再往試管中加入250 μL粗酶液，50℃保溫30 min。在試管中加入1．5 mL DNS試劑，再沸水浴7 min，然后用冷流水冷卻終止反應(yīng)。用蒸餾水定容至10 mL，充分混勻。用滅活酶液作空白對(duì)照。在550 nm下測(cè)吸光度值。酶活力單位的定義為：在50℃、pH5．2的條件下，每分鐘水解底物生成1 μg D-木糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位“U”[16]。

1．4．4 淀粉酶活力測(cè)定

吸取4 mL可溶性淀粉溶液于試管中，置于60℃恒溫水浴中預(yù)熱5 min。加入磷酸緩沖液1 mL，再加入粗酶液500 μL，計(jì)時(shí)反應(yīng)30 min。立即吸取反應(yīng)液1 mL，加入盛有0．5 mL稀鹽酸和5 mL稀碘液的試管中，搖勻。用滅活酶液作空白對(duì)照。在660 nm處測(cè)定吸光度。酶活力單位定義：在 60℃、pH6．0條件下，每分鐘液化1 μg可溶性淀粉，定義為1個(gè)淀粉酶活力單位“U”[17]。

1．4．5 蛋白酶活力測(cè)定

在2 mL離心管內(nèi)加入粗酶液0．5 mL，置于40℃水浴中預(yù)熱2 min，再加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酪蛋白0．5 mL，精確保溫30 min。時(shí)間到后，立即再加入0．4 mol·L-1的三氯乙酸1 mL，以終止反應(yīng)。8 000 r·min-1離心1 min。另取10 mL離心管若干，每管內(nèi)加入上清液1 mL，再加0．4 mol·L-1碳酸鈉5 mL，福林酚試劑100 μL，搖勻，40℃保溫發(fā)色20 min，以滅活的酶液為對(duì)照。于660 nm處測(cè)定吸光度。酶活力單位的定義為：在40℃、pH7．2條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg·L-1酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位“U”[18]。

1．4．6 漆酶活力測(cè)定

準(zhǔn)確移取HAc-NaAc緩沖液 (pH4．5)2．7 mL、1 mmol·L-1ABTS溶液0．2 mL，混合，搖勻，在30℃恒溫水浴鍋中水浴預(yù)熱5 min。將上述混合試劑倒入容積為3 mL的比色皿中，420 nm處調(diào)零。準(zhǔn)確加入粗酶液100 μL，立即記錄吸光值，每隔30 s記錄1次，共記錄3 min。酶活力單位的定義為：每分鐘氧化1 μmol底物所需要的酶量為一個(gè)酶活單位“U”[11]。1.4.7 錳過(guò)氧化物酶活力測(cè)定

準(zhǔn)確移取4 mmol·L-1愈創(chuàng)木酚 0.7 mL、100 mmol·L-1pH4.5琥珀酸鈉緩沖液2 mL、2.5 mmol·L-1的H2O20.1 mL、5 mmol·L-1的MnSO40.2 mL，混合，搖勻，在40℃恒溫水浴鍋中水浴預(yù)熱5 min。將上述混合試劑倒入容積為3 mL的比色皿中，465 nm處調(diào)零。加入0.2 mL粗酶液，立即記錄吸光值，每隔30 s記錄1次，共記錄3 min。酶活力單位的定義為：每分鐘氧化1 μmol MnSO4的酶量為一個(gè)酶活單位“U”[19]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用DPS軟件LSD多重比較法進(jìn)行單因素方差分析，用EXCEL軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑玉蕈菌包的酶活性

2.1.1 羧甲基纖維素酶活力變化

纖維素酶是一種能分解纖維素的胞外酶，是由多種水解酶組成的復(fù)雜酶系，可以一直將纖維素分解到葡萄糖為止，從而為菌絲生長(zhǎng)提供能源，是真菌碳代謝過(guò)程中的重要酶系。羧甲基纖維素酶活力隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時(shí)間變化見(jiàn)圖1。

由圖1可知，斑玉蕈菌包羧甲基纖維素酶活性比較低，在菌包培養(yǎng)的各個(gè)階段變化不大，活力基本維持在6 U·mL-1～8 U·mL-1。說(shuō)明斑玉蕈培養(yǎng)過(guò)程中始終存在降解纖維素的過(guò)程，也是斑玉蕈生產(chǎn)周期長(zhǎng)的原因之一。對(duì)羧甲基纖維素酶活力變化的方差分析（見(jiàn)表1）表明，各階段纖維素酶活性間差異不顯著。

圖1 羧甲基纖維素酶活力隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.1 Changes in cellulase activity of Hypsizygus marmoreus bag with incubation time

表1 羧甲基纖維素酶活力變化的方差分析Tab.1 Variance analysis on cellulase activities of Hypsizygus marmoreus bag

2.1.2 木聚糖酶活力變化

斑玉蕈在水解木聚糖時(shí)產(chǎn)生的酶往往是一個(gè)多酶復(fù)合體，各種酶相互調(diào)節(jié)和協(xié)同作用，才能使木聚糖完全降解。斑玉蕈生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程分泌木聚糖酶較多，因此可以作為判斷菌包成熟度的指標(biāo)。木聚糖酶活力隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時(shí)間的變化見(jiàn)圖2。

圖2 木聚糖酶活力隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.2 Change in xylanase activity of Hypsizygus marmoreus bag with incubation time

從圖2可以看出，菌包木聚糖酶活力隨著斑玉蕈菌包培養(yǎng)時(shí)間增加，酶活力也隨之逐步增高：菌包長(zhǎng)滿菌袋后，木聚糖酶活力從上部到下部逐步增強(qiáng)，酶活逐漸上升，到110 d之后就基本穩(wěn)定；隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時(shí)間而不斷增大，到后期上、中、下部的酶活力基本相同。主要原因是木聚糖酶可以分解木聚糖成為木糖，為菌包生長(zhǎng)提供能量。經(jīng)木聚糖酶活力變化方差分析（見(jiàn)表2） 表明，60 d菌包上、中、下部木聚糖酶酶活力差異顯著，140 d菌包上、中、下部木聚糖酶活力差異不顯著。2．1．3淀粉酶活力變化

表2 木聚糖酶活力變化的方差分析Tab.2 Variance analysis on xylanase activities of Hypsizygus marmoreus bag

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類(lèi)的統(tǒng)稱(chēng)。斑玉蕈培養(yǎng)料中含有大量淀粉，需將其水解后才能供給菌絲生長(zhǎng)發(fā)育，因此淀粉酶也是斑玉蕈碳代謝中關(guān)鍵酶之一。淀粉酶活性隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時(shí)間的變化見(jiàn)圖3。

圖3 淀粉酶活性隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig．3 Change in amylase activity of Hypsizygus marmoreus bag with incubation time

從圖3可以看出，淀粉酶活性在60 d～80 d時(shí)出現(xiàn)一個(gè)高峰，之后就逐漸降低。原因可能是斑玉蕈淀粉酶是誘導(dǎo)酶，隨著淀粉含量的減少酶活力逐步下降。100 d過(guò)后，菌絲已經(jīng)基本后熟完成，此時(shí)的生長(zhǎng)速度下降，酶活也降低并且較穩(wěn)定，保持在20 U·mL-1左右。淀粉酶活性變化經(jīng)方差分析（見(jiàn)表3）表明，70 d淀粉酶活性與110 d淀粉酶活性差異極顯著，110 d～140 d淀粉酶活性差異不顯著。

表3 淀粉酶活性變化的方差分析Tab．3 Variance analysis on xylanase activities of Hypsizygus marmoreus bag

2．1．4 中性蛋白酶活力變化

通過(guò)中性蛋白酶可把動(dòng)植物的大分子蛋白質(zhì)水解成小分子肽或氨基酸，以利于蛋白質(zhì)的有效吸收和利用。蛋白酶在菌絲吸收氮素營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。菌絲生長(zhǎng)發(fā)育所需要的氮源來(lái)自蛋白酶的水解作用。中性蛋白酶活性隨培養(yǎng)時(shí)間的變化及方差分析見(jiàn)圖4和表4。

由圖4可以看出，中性蛋白酶活力隨著斑玉蕈菌包培養(yǎng)時(shí)間不斷降低，可能原因是栽培料中的豆粕等有機(jī)氮逐漸用完，因此蛋白酶的需求量降低。由表4方差分析表明，60 d中性蛋白酶活性顯著高于140 d中性蛋白酶。

圖4 中性蛋白酶活性隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig．4 Change in proteinase activity of Hypsizygus marmoreus bag with incubation time

表4 中性蛋白酶活性變化的方差分析Tab．4 Variance analysis on proteinase activities of Hypsizygus marmoreus bag

2．1．5 漆酶活力變化

據(jù)研究發(fā)現(xiàn)很多食用菌菌體中富含漆酶。在菌體生長(zhǎng)過(guò)程漆酶不僅參與木質(zhì)素的降解，為菌體生長(zhǎng)提供養(yǎng)料；同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生酚類(lèi)或醌類(lèi)化合物抑制雜菌生長(zhǎng)，還參與菌包轉(zhuǎn)色過(guò)程，影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。漆酶活性隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時(shí)間的變化情況及方差分析見(jiàn)圖5和表5。

由圖5可以看出，菌包上部漆酶活力在70 d達(dá)到最高值，隨后降低至平均水平；中部與下部漆酶活力在100 d達(dá)到最大峰值，隨后各部分酶活力有波動(dòng)，總體維持在200 U·L-1左右。表5方差分析表明70 d菌包上、中、下部漆酶活力有顯著差異，110 d～130 d菌包上、中、下部漆酶活性差異不顯著。2．1．6 錳過(guò)氧化物酶活力變化

錳過(guò)氧化物酶活性隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時(shí)間的變化情況及方差分析見(jiàn)圖6和表6。

錳過(guò)氧化物酶與木質(zhì)素的降解密切相關(guān)。木質(zhì)素是高等植物的主要成分之一，主要存在于細(xì)胞壁中，占植物細(xì)胞壁的15%～30%。木質(zhì)素和半纖維素一起包圍著纖維素。在斑玉蕈培養(yǎng)階段，隨著栽培時(shí)間的延長(zhǎng)，錳過(guò)氧化物酶活性逐漸增強(qiáng)，才能先分解木質(zhì)素，再攝取細(xì)胞中更多的營(yíng)養(yǎng)，為其生長(zhǎng)發(fā)育所用。在菌絲后熟期間，錳過(guò)氧化物酶的活性呈上升的趨勢(shì)，菌絲后熟完成之后活性略有下降。各部分遵循先逐漸增高而后慢慢降低的規(guī)律：上部在80 d達(dá)到最大峰值，中部在90 d達(dá)到最大峰值，下部在110 d～120 d達(dá)到峰值，酶活力有41 U·mL-1（圖6）。經(jīng)方差分析表明，120 d菌包下部錳過(guò)氧化物酶活力顯著高于60 d菌包下部錳過(guò)氧化物酶活力。

圖5 漆酶活性隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.5 Change in laccase activity of Hypsizygus marmoreus bag with incubation time

表5 漆酶活性變化的方差分析Tab.5 Variance analysis on laccase activities of Hypsizygus marmoreus bag

2.2 菌包成熟度與生物學(xué)效率的關(guān)系

本研究采用工廠化穩(wěn)定生產(chǎn)中的斑玉蕈菌包作為試驗(yàn)材料，在環(huán)境條件、培養(yǎng)料的營(yíng)養(yǎng)配比、料水氣比例、菌種一致情況下，測(cè)定其前期酶活性變化，同時(shí)做了出菇管理實(shí)驗(yàn)，測(cè)定了菌包生物學(xué)效率。并參照作者之前發(fā)表文章[20]，從而可以為分析酶活力與出菇產(chǎn)量以及生物學(xué)效率之間關(guān)系提供依據(jù)。菌包培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌絲恢復(fù)泛白時(shí)間無(wú)影響，但是對(duì)原基形成時(shí)間和采摘時(shí)間有顯著影響。不同培養(yǎng)時(shí)間出菇產(chǎn)量和生物學(xué)效率各不相同，110 d之前產(chǎn)量和生物學(xué)效率隨著培養(yǎng)天數(shù)增加而增加，110 d之后差異不顯著。菌包不同培養(yǎng)時(shí)間出菇外觀有明顯的差別，但出菇時(shí)間不影響子實(shí)體色澤。培養(yǎng)時(shí)間加長(zhǎng)對(duì)子菌蓋厚度和子實(shí)體含水量影響也不顯著，但是對(duì)菌蓋大小和菌柄柄長(zhǎng)度有影響。

圖6 錳過(guò)氧化物酶活性隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.6 Change in manganese peroxidase activity of Hypsizygus marmoreus bag with incubation time

表6 錳過(guò)氧化物酶活性變化的方差分析Tab.6 Variance analysis on manganese peroxidase activities of Hypsizygus marmoreus bag

3 討論

本研究采用工廠化生產(chǎn)中的斑玉蕈菌包作為試驗(yàn)材料，設(shè)置平行和對(duì)照并進(jìn)行顯著性分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，后熟期不足導(dǎo)致原基形成晚，采摘時(shí)間推遲，成品率低下；后熟期過(guò)長(zhǎng)產(chǎn)量增加不明顯，并且增加了企業(yè)生產(chǎn)成本。因此本研究結(jié)果可為建立斑玉蕈菌包成熟度判定方法提供參照，為斑玉蕈工廠化生產(chǎn)過(guò)程中選擇正確出菇時(shí)間提供理論支持。

菌包菌絲體生長(zhǎng)階段，是培養(yǎng)料及菌絲體生理成熟度不斷提高和積累的過(guò)程。在環(huán)境條件適宜、培養(yǎng)料營(yíng)養(yǎng)配比得當(dāng)、料水氣比例合適，菌種優(yōu)良的前提下，斑玉蕈培養(yǎng)期間的一切變化都有一定規(guī)律，可根據(jù)前期表現(xiàn)預(yù)測(cè)后期結(jié)果。但是，纖維素酶活力在6 U·mL-1～8 U·mL-1波動(dòng)，后期增長(zhǎng)不明顯，這與對(duì)白靈菇的研究結(jié)果不同[20]。菌包內(nèi)含有大量纖維素，長(zhǎng)期需要纖維素酶，但本文該酶降解緩慢，其原因不明。淀粉酶活力變化趨勢(shì)與平菇液體培養(yǎng)及白靈菇、金針菇固體培養(yǎng)相似[21-23]，在后熟期后期活性低。由于淀粉酶可能是一種誘導(dǎo)酶，前期培養(yǎng)料中含有較高的淀粉，淀粉酶活力較高，后期淀粉分解含量低時(shí)，酶活力顯著下降。蛋白酶活力在無(wú)子實(shí)體形成時(shí)活力低，與王玉萬(wàn)的研究結(jié)果相似[24]，并且逐漸降低。這是因?yàn)榕囵B(yǎng)料中如豆粕等有機(jī)蛋白消耗完后，蛋白酶活力下降。木聚糖酶活力逐漸升高并且上部＞中部＞下部，后期上、中、下部活力差距減小，主要原因是木聚糖酶可以分解木聚糖成為木糖，為菌包生長(zhǎng)提供能量。這與周晨妍、胡奎娟等人研究結(jié)果有所不同[16，25]，可能是由于黑曲霉、木霉與斑玉蕈物種間的差異，導(dǎo)致酶活變化不呈“鐘”狀。上、中、下部漆酶活力都依次先上升后降低，后期差異不大，在200 U·L-1左右波動(dòng)。因?yàn)槠崦覆粌H參與木質(zhì)素降解，為菌體生長(zhǎng)提供養(yǎng)料，同時(shí)還產(chǎn)生酚類(lèi)或醌類(lèi)化合物抑制雜菌生長(zhǎng)，并且參與菌包轉(zhuǎn)色過(guò)程，影響產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量[11]。錳過(guò)氧化物酶活力變化趨勢(shì)與張丁倩研究結(jié)果相似[19]，前期上部＞中部＞下部，后期下部和中部逐漸超過(guò)上部，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌包下部酶活力超過(guò)中上部達(dá)到最高值即40 U·mL-1時(shí)，出菇品質(zhì)好，產(chǎn)量高。

從培養(yǎng)過(guò)程中斑玉蕈的木聚糖酶、漆酶、錳過(guò)氧化物酶等的活性變化可以看出，培養(yǎng)60 d～90 d這段階段酶活力波動(dòng)較大，此時(shí)菌絲生長(zhǎng)處于旺盛階段；110 d～120 d階段酶活力相對(duì)較平穩(wěn)，說(shuō)明此時(shí)菌絲生長(zhǎng)已經(jīng)基本達(dá)到生理后熟期；超過(guò)130 d酶活力又有大幅度變化，此時(shí)菌絲生長(zhǎng)超過(guò)一定的成熟度，產(chǎn)量有相應(yīng)的下降。在23℃溫度培養(yǎng)下，菌絲培養(yǎng)120 d，漆酶、木聚糖酶活力上、中、下趨于一致時(shí)，表示菌包已經(jīng)成熟，產(chǎn)量最高。因此，斑玉蕈工廠化生產(chǎn)菌包培養(yǎng)后熟不夠或過(guò)熟都會(huì)影響產(chǎn)量和外觀品質(zhì)。

研究斑玉蕈菌絲體生長(zhǎng)階段培養(yǎng)料各種關(guān)鍵酶活規(guī)律的意義在于：掌握菌絲體生長(zhǎng)階段酶活規(guī)律，有助于對(duì)生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控，及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、提前解決問(wèn)題，最大程度地降低因斑玉蕈生產(chǎn)周期長(zhǎng)而帶來(lái)的技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)；根據(jù)該變化規(guī)律，能夠?qū)π鹿に?、新技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供較為快捷的判斷標(biāo)準(zhǔn)或參考；把研究斑玉蕈菌絲體生長(zhǎng)階段酶活變化規(guī)律的方法應(yīng)用到其他菇類(lèi)上，有助于提高對(duì)其它菇類(lèi)生物學(xué)特征的認(rèn)識(shí)，更好地指導(dǎo)生產(chǎn)。

[1]劉建中，孫淑靜，胡開(kāi)輝，等．真姬菇融合菌株生物學(xué)特性及生產(chǎn)性能的研究[J]．中國(guó)食用菌，2010，29（3）：22-25．

[2]董巖，陳輝，趙明文，等．真姬菇栽培菌株的ITS和SSR分析[J]．上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25（3）：59-64．

[3]胡開(kāi)輝，劉建中，孫淑靜，等．斑玉蕈育種中漆酶轉(zhuǎn)化體系建立的初步研究[J]．菌物學(xué)報(bào)，2010（4）：528-535．

[4]林忠寧，陳敏健，劉明香，等．真姬菇菇腳和菌糠氨基酸含量測(cè)定及營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)[J]．中國(guó)食用菌，2012，31（2）：44-46．

[5]沙春娥，李富得，王振坤．利用油橄欖冬剪枝栽培真姬菇試驗(yàn)[J]．食用菌，2010（4）：35．

[6]蘇啟苞，劉傳森．利用木薯、木薯渣栽培真姬菇試驗(yàn)[J]．中國(guó)食用菌，2008，27（4）：59，61．

[7]程繼紅，馮志勇，高君輝．米糠添加量對(duì)真姬菇產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J]．食用菌學(xué)報(bào)，2004，11（1）：42-45．

[8]黃忠英．金針菇廢菌料栽培真姬菇試驗(yàn)[J]．食用菌，2014（4）：30-31．

[9]孫淑靜，顏松，胡開(kāi)輝．斑玉蕈不同菌種類(lèi)型的生產(chǎn)性能[J]．河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31（1）：66-69．

[10]胡開(kāi)輝，黃貴英，顏松，等．斑玉蕈低溫脅迫下菌絲體酶活變化及差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J]．菌物學(xué)報(bào)，2009，28（4）：584-590．

[11]郭艷艷，阮玲云，馮宏昌，等．不同營(yíng)養(yǎng)條件下斑玉蕈菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)酶特性[J]．菌物學(xué)報(bào)，2014（3）：697-705．

[12]胡開(kāi)輝，出小平．外界因子對(duì)蟹味菇菌絲特性的影響[J]．中國(guó)食用菌，2008，27（2）：16-18．

[13]程繼紅，馮志勇，高軍暉．栽培種培養(yǎng)時(shí)間對(duì)斑玉蕈產(chǎn)量和質(zhì)量的影響[J]．食用菌學(xué)報(bào)，2003，10（2）：45-49．

[14]高君輝，馮志勇，陳輝．斑玉蕈培養(yǎng)時(shí)間與栽培料失重、含水量和產(chǎn)量的關(guān)系[J]．食用菌學(xué)報(bào)，2008，15（3）：23-26．

[15]趙玉萍，楊娟．四種纖維素酶酶活測(cè)定方法的比較[J]．食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27(3)：116-118．

[16]周晨妍，張金華，馬雪婷，等．黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶的固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（21）：11052-11054．

[17]孫靜，耿慧莉，莫德馨．中溫α-淀粉酶活性的定量測(cè)定[J]．教學(xué)儀器與實(shí)驗(yàn)，2009，25（11）：44-45．

[18]SB/T10317-1999，蛋白酶活力測(cè)定法[S]．

[19]張丁倩，柯麗霞，趙文科，等．混菌固態(tài)發(fā)酵油菜秸稈銅離子和草酸對(duì)靈芝木質(zhì)素酶系分泌的影響[J]．安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，33（1）：57-61．

[20]張職視，林輝，王麗芬，等．斑玉蕈菌包理化指標(biāo)與其成熟度之間的關(guān)系[J]．中國(guó)食用菌，2015，34（5）：53-59．

[21]周長(zhǎng)青，王秀峰，李玉．白靈菇生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中胞外酶活性的變化規(guī)律[J]．食用菌學(xué)報(bào)，2008，15（2）：64-68．

[22]王宜磊．側(cè)耳液體培養(yǎng)特性及胞外酶活性研究[J]．中國(guó)食用菌，2000，19（4）：33-35．

[23]李蕤，吳克，駱軍，等．金針菇固體培養(yǎng)幾種胞外酶活力變化的研究[J]．中國(guó)食用菌，2002，21（1）：12-14．

[24]王玉萬(wàn)，潘貞德，李秀玉，等．玉蕈降解木質(zhì)纖維素的生理生化基礎(chǔ)[J]．真菌學(xué)報(bào)，1993，12（3）：219-225．

[25]胡奎娟，吳克，潘仁瑞，等．固態(tài)混合發(fā)酵提高木聚糖酶和纖維素酶活力的研究[J]．菌物學(xué)報(bào)，2007，26（2）：273-278．

Relationship Between Enzyme Activities and the Maturity of Hypsizygus marmoreous Bag

ZHANG Zhi-shi1,LIN Hui2,WANG Li-fen2,CHEN Gui-zhen2,LAI Shu-fang1, ZHAN Sen-ran1,LI Jia-huan1,SUN Shu-jing1,2,HU Kai-hui1,2
(1．College of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China; 2．Gutian Edible Fungi Research Institute,Fujian Agriculture and Forestry University,Gutian 352200,China)

In order to establish a scientific and reliable biological parameters evaluation index of Hypsizygus marmoreus bag maturity and provide a scientific basis for judgment of the industrialized H.marmoreus bag maturity,the relationship between cellulase,xylanase,amylase,proteinase,laccase,manganese peroxidase activities and different incubation time were analysed by 3,5-dinitrosalicyic acid method,Iodine-potassium iodide method,Folin-phenol method,ABTS method,Guaiacol method respectively．The results showed that cultivated about 120 days at 21℃-25℃,xylanase activities of the various parts of the fungi bag were about 13．7 U·mL-1and in upper part laccase activity reach maximum at 70 days,middle and lower part laccase activity reach maximum at 100 days,and various parts laccase activities of the fungi bag were about 173．5 U·L-1at 120 days．Cellulase activities were about 6 U·mL-1-8 U·mL-1．Amylase activities were about 20 U·mL-1．Proteinase activities were about 4 U·mL-1．Lower part anganese peroxidase activity reach 40 U·mL-1．The production of this period is up to 461．7 g·bag-1．

Hypsizygus marmoreus;enzyme activities;biological efficiency

S646.9

A

1003-8310（2016）01-0053-06

10．13629/j．cnki．53-1054．2016．01．015

福建省高校產(chǎn)學(xué)合作科技重大項(xiàng)目（2013N5101）；珍稀食用菌品種創(chuàng)新與自動(dòng)化生產(chǎn)技術(shù)產(chǎn)業(yè)化工程（2014S1477-8）；福建省食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)重大研發(fā)平臺(tái)（2014N2101）；福建省重大農(nóng)技推廣項(xiàng)目（KNJ-153000）。

張職視（1991-），男，碩士研究生，主要從事食用菌開(kāi)發(fā)與利用研究。E-mail:746830163＠qq．com

**通信作者：胡開(kāi)輝（1962-），男，本科，教授，主要從事食用菌栽培與遺傳育種研究。E-mail:2692609765＠qq．com

2015-11-01