王榮俊，童斯浩

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

姜黃素聯(lián)合紫杉醇對肺癌細(xì)胞PC9凋亡的影響

王榮俊1，童斯浩2

目的：研究姜黃素聯(lián)合紫杉醇對人肺癌細(xì)胞PC9凋亡的影響。方法：將不同濃度梯度姜黃素和紫杉醇單用(單藥組)和聯(lián)合(聯(lián)合組)作用于PC9細(xì)胞，MTT法測定其對PC9的增殖抑制作用，流式細(xì)胞術(shù)檢測單藥和雙藥聯(lián)合對細(xì)胞周期分布和凋亡的影響，Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：兩藥均以時間和劑量依賴方式抑制PC9細(xì)胞的增殖，聯(lián)合組抑制作用大于單藥組(P<0.01)。兩藥均能誘導(dǎo)PC9細(xì)胞發(fā)生凋亡和G0/G1期阻滯，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡和G0/G1期阻滯作用顯著增強(qiáng)(P<0.01)。Western blot法檢測顯示，聯(lián)合組Caspase-3蛋白、Bcl-2、Bax的改變顯著大于單藥組(P<0.01)。結(jié)論：姜黃素、紫杉醇可抑制人肺癌PC9細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，阻滯細(xì)胞G0/G1期，伴隨Caspase-3活性上調(diào)，且兩者聯(lián)合應(yīng)用可顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

肺腫瘤；姜黃素；紫杉醇；凋亡

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，隨著工業(yè)化進(jìn)程加快及全球環(huán)境惡化，在我國已成為發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，尋找低毒高效的治療手段是肺癌面臨的巨大挑戰(zhàn)[1-2]。姜黃素(CUR)是從中藥姜黃中提取的一種有效化學(xué)成分，具有多種抗腫瘤活性機(jī)制，且不良反應(yīng)少[3]。紫杉醇(PA)是抗微管微絲類化療藥，是多種惡性腫瘤化療的一線藥物。本研究以人肺癌細(xì)胞PC9為研究對象，通過研究CUR聯(lián)合PA對PC9細(xì)胞的促凋亡作用，為肺癌的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀、垂直電泳槽、濕式轉(zhuǎn)膜儀購于美國BIO-RAD公司；離心機(jī)購自于德國Eppendorf公司；CO2培養(yǎng)箱購于中國貝博公司。實驗用藥物購自中國貝博公司；實驗用細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。高糖DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、四甲基偶氮唑藍(lán)、實驗用抗體購于中國貝博公司及美國Cell Single公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖抑制實驗 取實驗用細(xì)胞消化、離心后接種至96孔板中，設(shè)3個復(fù)孔。設(shè)CUR 20 μmol/L(CVR組)、PA 0.1 μmol/L(PA組)和CUR 20 μmol/L+PA 0.1 μmol/L(CVR+PA組) 3個梯度。對照組不加藥。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入MTT，以酶標(biāo)儀在490 nm雙波長檢測相應(yīng)的吸光度，實驗重復(fù)6次。

1.2.2 細(xì)胞周期及凋亡的變化 取實驗用細(xì)胞懸液種于6孔板中。CVR組、PA組、CUR+PA組加藥后培養(yǎng)24 h，消化、離心細(xì)胞后4 ℃ 70%無水乙醇固定過夜，次日，PBS洗滌離心細(xì)胞后加入400 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI) 染液，以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化，實驗重復(fù)6次。同樣取細(xì)胞按上述藥物濃度培養(yǎng)24 h后洗滌,收集細(xì)胞入流式管中，標(biāo)記抗體后，采用流式細(xì)胞儀檢測其凋亡。實驗重復(fù)6次。

1.2.3 Western blot法檢測蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，每孔2 mL，實驗設(shè)CUR 20 μmol/L、PA 0.1 μmol/L、CUR 20 μmol/L+PA 0.1 μmol/L 3個實驗組，加藥后培養(yǎng)24 h，胰酶消化、離心，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2遍，棄上清液，收集各組細(xì)胞。各組細(xì)胞加入蛋白裂解液裂解細(xì)胞，以BCA法蛋白定量，每孔30 μg上樣，電泳轉(zhuǎn)膜后封閉，先后以小鼠抗人Caspase-3、Bcl-2、Bax單抗、山羊抗小鼠二抗孵育，ECL顯影，暗室曝光成像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用單因素方差分析及校正t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩藥對肺癌細(xì)胞PC9增殖抑制的影響 MTT結(jié)果顯示，兩藥單獨(dú)作用下，均對肺癌細(xì)胞PC9有增殖抑制作用。兩藥聯(lián)合時，其增殖抑制效應(yīng)均較單藥更為明顯(P<0.01)(見表1)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及周期的影響 兩藥聯(lián)合聯(lián)合作用下，細(xì)胞周期中G0/G1期細(xì)胞群分布50%左右，較單藥組明顯增加。流式凋亡分析顯示，CUR+PA組凋亡率67%左右，均明顯高于CUR和PA組(P<0.01)(見圖1、表2)。

表1 各組PC9細(xì)胞增殖抑制率比較±s)

q檢驗：與CUR+PA組比較**P<0.01

分組凋亡率/%細(xì)胞群/% G0/G1 S G2/M 對照組4.72±0.1328.71±1.3153.47±2.8818.18±0.93CUR組28.43±1.92**△△35.29±2.01**△△57.82±3.10**△△7.10±0.51**△△PA組26.35±2.81**△△37.12±2.83**△△54.78±2。91**△△8.31±0.41**△△CUR+PA組66.54±3.31**48.93±2.12**47.53±2.14**3.67±0.19**F975.9094.2015.23683.60P<0.01<0.01<0.01<0.01MS組內(nèi)5.6914.5757.7480.333

q檢驗與對照組比較**P<0.01；與CUR+PA組比較△△P<0.01

2.3 Western blot法檢測相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響 兩藥作用后，活性Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增高,Bcl-2表達(dá)下調(diào),Bax表達(dá)上調(diào)，各組與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)，CUR+PA組和單藥組相比差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表3)。

3 討論

肺癌的治療手段多樣，化療仍是最主要的治療方式，但總生存時間及無病生存時間仍不盡如人意，因此，尋找低毒高效的新型藥物意義重大。

表3 各組蛋白質(zhì)表達(dá)相對灰度值比較

q檢驗：與對照組比較*P<0.05，**P<0.01與CUR+PA組比較△△P<0.01

CUR廣泛存在于姜科植物中，研究證實，CUR在體外可以協(xié)同氟尿嘧啶等對結(jié)腸癌等多種細(xì)胞株具有協(xié)同殺傷效應(yīng)[4-5]，可以通過抑制NF-κB、cyclinD1、XIAP等，實現(xiàn)抗腫瘤效應(yīng)[6]，且其抗瘤譜廣、不良反應(yīng)少，在抗腫瘤或化療增敏中具有良好前景。PA是抗微管藥物，其在多種惡性腫瘤治療中均為一線用藥。

細(xì)胞凋亡是指在基因調(diào)控下產(chǎn)生的主動死亡過程，其中Caspase聯(lián)級反應(yīng)是影響細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制[7]。Caspase家族中Caspase-3是否被激活是細(xì)胞凋亡的決定性因素。Bcl-2家族蛋白是影響線粒體凋亡途徑的重要蛋白群，表達(dá)于線粒體膜上及膜內(nèi)，其家族中的抗凋亡蛋白Bcl-2 及促凋亡蛋白Bax共同維持著線粒體膜的穩(wěn)定性，是細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)之一[8]。

本實驗結(jié)果顯示，兩藥單獨(dú)及聯(lián)合作用于肺癌PC9細(xì)胞后，均對其具有增殖抑制作用，且聯(lián)合組高于單藥組。流式細(xì)胞術(shù)顯示，兩種藥物均對細(xì)胞株P(guān)C9有促凋亡和周期阻滯作用，且聯(lián)合組高于單藥組。另外，Western blot顯示，聯(lián)合組中活性Caspase-3蛋白的上調(diào)、Bcl-2下調(diào)、Bax表達(dá)上調(diào)，提示聯(lián)合組藥物抗腫瘤機(jī)制可能與激活線粒體凋亡相關(guān)，可為CUR的抗腫瘤作用提供理論基礎(chǔ)。

綜上，本實驗結(jié)論為CUR的臨床抗腫瘤作用提供了更為直接的理論依據(jù)。但對于CUR可能涉及到的其他抗腫瘤途徑和分子、動物模型的建立，以及臨床效應(yīng)觀察尚需進(jìn)一步研究。

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(本文編輯 周洋)

The effect of curcumin combined with paclitaxel on lung cancer cell PC9

WANG Rong-jun1,TONG Si-hao2

(1.MedicalSchootofHefeiTechnicalChollege,ChaohuAnhui238000;2.DepartmentofOncology,TheChaohuAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,ChaohuAnhui238000,China)

Objective:To study the apoptosis-inducing effects of curcumin(CUR) combined with paclitaxel(PA)on lung cancer cell line PC9.Methods:The PC9 cells were treated with different concentrations of single drug or two drugs combination.The anti-proliferative effect of drug was measured using MTT.The effects of single drug and two drugs combination on the cell cycle distribution and apoptosis were measured by flow cytometry.The expressions of apoptosis-related protein were detected by western blotting.Results:Two drugs could inhibit the prolification of PC9 cells with time-and concentration-dependent manner,and the profilication inhibiting rate of curcumin combined with paclitaxel was higher than that of CUR or PA.The apoptosis and G0/G1phase arrest of PC9 cells treated with drug combination significantly enhanced(P<0.01).The protein expression changes of Caspase-3,Bcl-2 and Bax in PC9 cells teated with drug combination were significantly more than that with single drug(P<0.01).Conclusions:The CUR and PA can inhibit the proliferation of human lung cancer cell PC9,induce apoptosis,block cell G0/G1phase and inprove the Caspase-3 activity.Two drugs combination can significnatly promote the PC9 cells apoptosis.

lung neoplasms;curcumin;paclitaxel;apoptosis

2016-03-31

1.合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分院，安徽 巢湖 238000；2.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院 腫瘤科，安徽 巢湖 238000

王榮俊(1964-)，男，副教授.

1000-2200(2016)12-1549-03

R 734.2

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.12.003