路黎娟,徐梅佳,董 焱
·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·
重組人粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠凋亡誘導(dǎo)因子表達(dá)的影響
路黎娟,徐梅佳,董 焱
目的:研究分析重組人粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)新生SD大鼠凋亡誘導(dǎo)因子表達(dá)的影響。方法:隨機(jī)選取7日齡SD大鼠36只,隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、腦缺血再灌注組(B組)和藥物治療組(C組),每組各12只。采用Longa線栓法制作大鼠大腦動(dòng)脈閉塞再灌注模型,C組大鼠在腦缺血2 h后及24 h時(shí)給予藥物灌注,其余2組給予大鼠注射等量的0.9%氯化鈉注射液。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,采用Longa 5分制標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法在24 h時(shí)對(duì)大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分,采用免疫組織化學(xué)法對(duì)大鼠的組織磷酸化c-jun氨基末端激酶、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡、TTC染色測(cè)腦梗死體積進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。對(duì)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)及凋亡水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果:A組僅有一小部分凋亡細(xì)胞,B、C 2組在灌注24 h后可以發(fā)現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞,細(xì)胞核均呈棕褐色,主要分布在缺血腦組織中周圍;C組腦梗死程度較B組減輕(P<0.01)。結(jié)論:重組人粒細(xì)胞集落刺激因子可以起到保護(hù)新生SD大鼠神經(jīng)細(xì)胞的作用,避免發(fā)生缺血缺氧性腦損傷,這種糖蛋白與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。
腦損傷;缺血缺氧性;重組人粒細(xì)胞集落刺激因子;大鼠
新生兒缺血缺氧性腦病是指患兒在圍生期發(fā)生窒息,導(dǎo)致腦組織缺氧性損傷,是新生兒的常見病之一。該病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及多個(gè)環(huán)節(jié),而細(xì)胞凋亡是后期神經(jīng)細(xì)胞缺失和功能障礙的重要原因[1]。腦組織一旦發(fā)生損傷,很有可能進(jìn)一步引起患兒神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生損傷,很多患兒均遺留下不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,嚴(yán)重影響著患兒正常的生活。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)可以刺激中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生,并且rhG-CSF對(duì)大腦組織起到保護(hù)作用,可以修復(fù)并改善神經(jīng)系統(tǒng)的功能[2]。細(xì)胞凋亡的過程中受到多種基因調(diào)控及外界因素的影響,本研究通過建立新生SD大鼠大腦動(dòng)脈閉塞再灌注模型,旨在研究rhG-CSF對(duì)大鼠凋亡誘導(dǎo)因子表達(dá)的影響。
1.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:為我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心提供的新生7日齡清潔級(jí)健康SD大鼠36只,每只質(zhì)量12~15 g。試驗(yàn)儀器:博士德SA2001免疫組織化學(xué)試劑盒(上海澤邁技術(shù)有限公司);TBBY-3503-50 mL DAB顯色試劑盒(上海拓旸生物科技有限公司);TUNEL試劑盒(上海美軒生物科技有限公司);上海君瑞JR01523PBS粉劑(上海君瑞生物技術(shù)有限公司);BL-HC-0570微量加樣器(上海博光生物科技有限公司);TC-150Q病理組織脫水機(jī)(沈陽市龍首電子儀器有限公司);TB-FL1病理組織包埋機(jī)(武漢天之瑞醫(yī)療科技有限公司)。實(shí)驗(yàn)試劑:RHG-CSF(北京四環(huán)生物制藥有限公司);兔抗大鼠p-JNK1/2單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)公司);兔抗大鼠p-ERK1/2單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)公司);構(gòu)椽酸鹽緩沖液(0.01 mmol/L,pH 6.0)(ZLI-9064)。
1.2 方法 將所有大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、腦缺血再灌注組(B組)和藥物治療組(C組),每組各12只。每組再次隨機(jī)選出6只大鼠,分別進(jìn)行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色,并測(cè)定其腦梗死體積,其余6只大鼠采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)磷酸化c-jun氨基末端激酶(p-JNK)及磷酸化胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK)水平的表達(dá),利用Tunel檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。A組僅將大鼠頸部的動(dòng)脈進(jìn)行分離;B、C組采用Longa線栓法制作大鼠大腦動(dòng)脈閉塞再灌注模型,在大鼠缺血2 h后進(jìn)行藥物灌注;完成模型的建立后,C組大鼠在再灌注時(shí)及24 h時(shí)給予注射rhG-CSF,劑量為50 μg/kg,其余2組給予小鼠注射相同體積的0.9%氯化鈉注射液。
1.2.1 線栓法制作大鼠大腦動(dòng)脈閉塞再灌注模型[3]首先使用尼龍魚線制作直徑約為0.28 mm的線栓,采用改良線栓法對(duì)大鼠右側(cè)的大腦中動(dòng)脈進(jìn)行阻斷,建立局灶性腦缺血再灌注模型。所有大鼠在手術(shù)前禁食12 h,飲水不限制。對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉,取仰臥位,手術(shù)部位進(jìn)行消毒,對(duì)頸部進(jìn)行切割,使其頸動(dòng)脈暴露在外部,在頸總動(dòng)脈分叉處一切口,將魚線沿切口插入,其次對(duì)頸動(dòng)脈進(jìn)行掛線結(jié)扎(防止出血),緩慢推進(jìn)線栓,使其置于頸內(nèi)動(dòng)脈17~18 mm處,出現(xiàn)輕微阻力時(shí)即停止推動(dòng)。再縫合皮膚并做標(biāo)記。缺血后2 h時(shí)對(duì)大鼠進(jìn)行灌注。A組大鼠僅分離頸部不插魚線。
1.2.2 標(biāo)本收集與處理 在完成行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè)后,麻醉大鼠,剝開大鼠胸部使其心臟暴露,剪開右心耳,給予灌注100 mL 0.9%氯化鈉注射液(37 ℃),將血漬沖洗干凈后,給予灌注250 mL多聚甲醛(4%,pH 7.4),標(biāo)本固定后取大鼠頭腦組織浸泡于10%甲醛中,24 h后取出,制片[4]。
1.2.3 指標(biāo)檢測(cè) 分別進(jìn)行TTC染色測(cè)定腦梗死體積,免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)p-JNK、p-ERK,原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(Tunel)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
1.3 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)
1.3.1 神經(jīng)功能評(píng)分及入選標(biāo)準(zhǔn) 采用Longa 5分制標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法[3]在24 h時(shí)對(duì)大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分,評(píng)分等級(jí)有0~4分,其中,0分:無神經(jīng)功能損傷癥狀;1分:大鼠左側(cè)前肢無法正常伸展;2分:大鼠在術(shù)后行走向左轉(zhuǎn)圈;3分:大鼠在術(shù)后行走向左傾斜;4分:不能正常行走,沒有意識(shí)。將0分及4分的大鼠剔除,并補(bǔ)足。
1.3.2 TTC染色 在完成染色后,使用數(shù)碼相機(jī)拍照,利用圖像處理軟件計(jì)算腦梗死的體積,計(jì)算梗死體積占大腦總體積的百分比。
1.3.3 免疫組織化學(xué)染色 在完成染色后,若免疫細(xì)胞被染成棕黃色即為p-JNK1/2和p-ERK1/2陽性細(xì)胞。采用B-I2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量染色陽性細(xì)胞的平均灰度值[5]。
1.3.4 Tunel凋亡細(xì)胞 在完成染色后,若細(xì)胞被染成棕黃色即為Tunel陽性細(xì)胞,則細(xì)胞凋亡。計(jì)算陽性細(xì)胞的百分比平均值。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)。
2.1 模型建立情況 A組大鼠沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象且神經(jīng)功能正常;B組大鼠手術(shù)后精神情況不佳、活動(dòng)少、反應(yīng)遲緩且進(jìn)食相對(duì)于A組較少,且大鼠的左側(cè)前后肢均不能正常伸展,行走時(shí)有向左側(cè)傾斜的趨勢(shì),嚴(yán)重者會(huì)摔倒;C組大鼠的情況較為正常,明顯優(yōu)于A、B 2組。
2.2 3組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積比較 A組小鼠無神經(jīng)功能發(fā)生損傷者,神經(jīng)功能評(píng)分為0分,B、C 2組小鼠的神經(jīng)功能均發(fā)生不同程度的損傷,B組神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于C組(P<0.01)。TTC染色結(jié)果顯示,染色梗死區(qū)顯示白色,非梗死區(qū)顯示紅色,A組未發(fā)現(xiàn)梗死現(xiàn)象,腦梗死體積為0,B、C 2組均出現(xiàn)不同程度的梗死現(xiàn)象,C組腦梗死體積明顯小于B組(P<0.01) (見圖1、表1)。
表1 B組和C組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積比較±s)
2.3 病理學(xué)觀察
2.3.1 肉眼觀察 A組腦組織細(xì)胞形態(tài)及色澤均與正常細(xì)胞一致;B組梗死一側(cè)腦組織腫大,動(dòng)脈供血區(qū)蒼白且無光澤,腦組織表面血管顏色較正常者淺;C組癥狀與B組相比較輕微(見圖1)。
2.3.2 HE染色觀察 將3組大鼠細(xì)胞置于光學(xué)顯微鏡下觀察,A組細(xì)胞結(jié)構(gòu)與正常細(xì)胞一致,且輪廓清晰,有多種形態(tài):錐形、星形、梭形,細(xì)胞核為藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)為紫紅色,核膜清晰,無壞死細(xì)胞;B組神經(jīng)細(xì)胞較少,細(xì)胞間隙大,梗死灶周神經(jīng)元腫大,且呈空泡化,細(xì)胞核縮小,細(xì)胞間質(zhì)水腫;C組細(xì)胞所有病變情況較B組輕微(見圖2)。
2.4 p-JNK、p-ERK表達(dá)及凋亡細(xì)胞檢測(cè) B、C 2組中均有染色顯示棕黃色的細(xì)胞,即在腦缺血灶周邊均存在p-JNK陽性細(xì)胞,染色主要出現(xiàn)在細(xì)胞核上,少數(shù)出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)上。C組大鼠的腦組織p-JNK表達(dá)相對(duì)于B組小鼠有所升高(P<0.01)(見圖3、表2);A組小鼠腦組織僅有少數(shù)p-ERK陽性細(xì)胞,B、C 2組腦缺血灶周邊存在大量p-ERK陽性細(xì)胞,但C組p-ERK的表達(dá)相對(duì)于B組較少(P<0.01)(見圖4、表2);A組僅有一小部分的凋亡細(xì)胞,B、C 2組在灌注24 h后可以發(fā)現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞,細(xì)胞核均呈棕褐色,主要分布在缺血腦組織,C組相對(duì)于B組較少(P<0.01) (見圖5、表2)。
表2 p-JNK、 p-ERK表達(dá)及凋亡細(xì)胞檢測(cè)
q檢驗(yàn):與A組比較**P<0.01;與B組比較△△P<0.01
近年來,很多新生兒在出生后出現(xiàn)缺血缺氧性腦損傷,其主要原因是新生兒在圍生期發(fā)生窒息。1%~6%新生兒出現(xiàn)缺血缺氧性腦病,多數(shù)新生兒智力發(fā)展會(huì)受到影響,20%~40%發(fā)展為神經(jīng)功能障礙,患兒會(huì)出現(xiàn)癲癇、腦癱、智力聽力障礙或精神出現(xiàn)問題。有多種機(jī)制導(dǎo)致這種現(xiàn)象的發(fā)生,其中包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡以及興奮性中毒等,線粒體是有氧氧化和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵部位[6-7]。粒細(xì)胞集落因子(G-CSF)是一種含有174個(gè)氨基酸的糖蛋白,首次發(fā)現(xiàn)是在造血細(xì)胞中,被認(rèn)為是造血系統(tǒng)中特異性及其生長(zhǎng)因子,可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的增殖與分化,鼠G-CSF與人類G-CSF的蛋白序列同源性高達(dá)73%,因此一般用鼠進(jìn)行G-CSF相關(guān)實(shí)驗(yàn)[8]。G-CSF自發(fā)現(xiàn)以來一直用于粒細(xì)胞減少的各種病癥,G-CSF可以穿過血腦屏障,且在整個(gè)過程中可以減緩腦組織缺血或再灌注引起的危害。rhG-CSF是通過基因重組技術(shù)產(chǎn)生的,具有保護(hù)神經(jīng)組織的作用,rhG-CSF的神經(jīng)保護(hù)作用主要包含以下幾個(gè)方面[9-10]:(1)促進(jìn)骨髓干細(xì)胞遷移至腦部受損區(qū)域,主動(dòng)動(dòng)員骨髓干細(xì)胞向病變部位移動(dòng),且可穿過血腦屏障使受損的區(qū)域轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元;(2)rhG-CSF可以通過JAK/Stat途徑引起B(yǎng)cl-2的過表達(dá),從而抑制神經(jīng)元的凋亡,另外,可激活ERK1/2,從而進(jìn)一步提高神經(jīng)細(xì)胞的增殖能力,抑制細(xì)胞凋亡;(3)rhG-CSF可充分抑制T淋巴細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的移動(dòng),減少γ-干擾素(IFN-γ)的表達(dá),同時(shí)增加IL-4和腫瘤壞死因子(TGF)-β1的表達(dá),最終使炎性作用減少;(4)可促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)多個(gè)區(qū)域的表達(dá)G-CSF,從而產(chǎn)生新的神經(jīng)元,促進(jìn)大腦功能的恢復(fù);(5)可以促進(jìn)腦部血管的生長(zhǎng),增加梗死神經(jīng)周圍血管面積、長(zhǎng)度等;(6)促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌。
本研究結(jié)果顯示,A組的大鼠沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象且神經(jīng)功能正常;B組的大鼠手術(shù)后精神情況不佳、活動(dòng)少、反應(yīng)遲緩且進(jìn)食相對(duì)于A組較少,且大鼠的左側(cè)前后肢均不能正常伸展,行走時(shí)有向左側(cè)傾斜的趨勢(shì),嚴(yán)重者會(huì)摔倒;C組大鼠的情況較為正常,明顯優(yōu)于B組。A組小鼠神經(jīng)功能沒有發(fā)生損傷,神經(jīng)功能評(píng)分為0分,其余2組小鼠的神經(jīng)功能均發(fā)生不同程度的損傷,B組明顯高于C組(P<0.01)。TTC染色結(jié)果顯示,A組未發(fā)現(xiàn)梗死現(xiàn)象,其余2組均出現(xiàn)不同程度的梗死現(xiàn)象,C組明顯小于B組(P<0.01)。B組和C組大鼠在腦缺血灶周邊均存在p-JNK、p-ERK陽性細(xì)胞,染色主要出現(xiàn)在細(xì)胞核上,少數(shù)出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)上。C組大鼠的腦組織p-JNK較B組升高(P<0.01),而p-ERK表達(dá)相對(duì)于B組有所下降;A組僅有一小部分的凋亡細(xì)胞,其余2組在灌注24 h后可以發(fā)現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞,C組相對(duì)于B組較少(P<0.01)。
綜上所述,rhG-CSF可以起到保護(hù)新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞的作用,避免發(fā)生缺血缺氧性腦損傷,可能與其調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。
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(本文編輯 劉暢)
Effect of recombinant human granulocyte colony stimulating factor on the expression of apoptosis inducing factor in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage
LU Li-juan,XU Mei-jia,DONG Yan
(DepartmentofPediatrics,TheNinthPeople′sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai201999,China)
Objective:To study the effects of recombinant human granulocyte colony stimulating factor(rhG-CSF) on the expression of apoptosis inducing factor(AIF) in neonatal SD rats.Methods:Thirty-six healthy neonatal SD rats with 7 days old were randomly divided into the sham operation group(group A),cerebral ischemia reperfusion group(group B) and drug treatment group(group C)(12 rats each group).The rat cerebral arterial occlusion reperfusion model was made using Longa suture blot method.The group C were injected with drug after two hours and 24 hours of cerebral ischemia,and the other two groups were injected with the same amount of normal saline.At the end of the experiment,the neural function of rat was evaluated by Longa 5 score method,the expressions of extracellular signal regulated protein kinase(p-ERK) and phosphorylated extracellular signal regulated protein kinase(p-JNK) were detected by immunohistochemical method,and the neuronal apoptosis and cerebral infarction volume were detected using Tunel and TTC staining,respectively.The levels of expression and apoptosis of apoptosis related genes were evaluated.Results:A small part of the apoptotic cells in A group and large number of apoptotic cells and brown nuclei in groups B and C after 24 h of reperfusion were found,which distributed mainly around the ischemic brain tissue,and which in C group was less than that in group B(P<0.01).Conclusions:rhG-CSF can protect the neuron of neonatal rat,and avoid the occurrence of ischemic hypoxic brain damage,which is related to the expression of the apoptosis related gene.
brain injury;ischemia and hypoxia;recombinant human granulocyte colony stimulating factor;rat
2015-11-30
上海市高校選拔優(yōu)秀青年教師專項(xiàng)基金(ZZjdyx12114)
上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 兒科,上海 201999
路黎娟(1984-),女,主治醫(yī)師.
1000-2200(2016)12-1545-05
R 364.4
A
10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.12.002