丁 亞，劉錦波

·基礎醫(yī)學·

小鼠脊髓損傷中的長鏈非編碼RNA表達譜

丁 亞，劉錦波

目的：研究脊髓損傷中的差異性長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)表達譜。方法：應用MASCIS脊髓撞機儀制造小鼠脊髓損傷模型，按照損傷后取脊髓時間再分成1 d、3 d、7 d和21 d組及正常對照組，分別提取總RNA，進行芯片分子雜交，構建脊髓損傷后差異性LncRNA表達譜，挑選神經(jīng)組織特異性LncRNA通過熒光定量PCR實驗驗證芯片結果可靠性，對差異性表達LncRNA所參與的信號通路進行分析。結果：脊髓損傷后LncRNA出現(xiàn)差異性表達，損傷后7 d出現(xiàn)了差異性表達最大值，熒光定量PCR實驗驗證芯片結果可靠，差異性LncRNA涉及較多信號通路。結論：LncRNA在脊髓損傷中病理過程中發(fā)生了差異性表達。

脊髓損傷；長鏈非編碼RNA；信號通路；小鼠

神經(jīng)損傷難以恢復，尤其是脊髓損傷更是世界性難題，往往造成患者終生殘疾及經(jīng)濟負擔，引起很多社會心理問題[1]。脊髓損傷是一個復雜的病理過程，涉及到許多細胞及分子變化[2]。因此，尋找有效治療脊髓損傷的方法必須明確脊髓損傷病理過程。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度>200 nt，缺乏顯著開放閱讀框的非編碼RNA。其曾被認為是分子噪音，近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)LncRNA與神經(jīng)發(fā)育密切相關[3]，參與神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育和功能完善[4]。作為非編碼RNA的重要組成部分，LncRNA參與了神經(jīng)元分化、腦發(fā)育及突觸可塑性[5]。LncRNA通過調(diào)控編碼基的表達，使神經(jīng)系統(tǒng)按照一定的時間和空間順序進行生長和發(fā)育[6]。LncRNA在胚胎時期就參與了胚胎細胞定向分化成神經(jīng)細胞過程[7]。因此，探索脊髓損傷過程中LncRNA的表達變化有助于我們進一步認識脊髓損傷病理過程。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及動物模型[8-9]雌性ICR小鼠(蘇州大學實驗動物中心提供)15只，體質量為20～25 g，分成5組(3只/組)：正常對照組；SCI組，按照損傷后取脊髓的時間再分成1 d、3 d、7 d和21 d組。SCI組動物用0.35%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，深度麻醉后，俯臥位，取正中最高點為中心，備皮后，消毒常規(guī)鋪巾，行背部正中切口，分離椎旁肌，顯露T11～L1棘突及椎板，咬去棘突及椎板后，充分顯露脊髓背側，利用MASCIS脊髓撞機儀制造小鼠脊髓損傷模型。小鼠隨后出現(xiàn)下肢對稱性抽搐，出現(xiàn)下肢癱瘓。逐層縫合肌肉筋膜及皮膚。SCI組動物術后表現(xiàn)雙下肢癱瘓及膀胱膨脹，予以早晚膀胱按摩人工排尿各1次。正常對照組不作處理。所有實驗動物均予相同飲食及光照，存活良好。

1.2 RNA的提取及芯片雜交 分別處死實驗動物后取以損傷點為中心頭端及尾端各5 mm的脊髓組織，按照Invitrogen公司說明書步驟，利用Trizol(Invitrogen，美國)提取組織總RNA。利用微量分光光度計測量總RNA濃度，每組內(nèi)個體(3只)總RNA等質量混合為芯片雜交準備。利用Affaystar Mouse LncRNA Expression Micraoarray芯片(Arraystar，美國)進行RNA雜交，利用GeneChip Scanner 3000 7G型掃描儀掃描芯片的熒光信號強度，得到原始微點陣圖片，并將圖片輸入Affymetrix GeneChip Operating Software以進行數(shù)據(jù)分析，采用Affymetri Expression Console進行數(shù)據(jù)解析。

1.3 熒光定量PCR驗證實驗 挑選8個神經(jīng)系統(tǒng)特異性LncRNA進行實時定量熒光逆轉錄多聚酶鏈反應(qRT-PCR)驗證，分別以來自5組小鼠脊髓提取的總 RNA逆轉錄cDNA為模板，采用ABI 7500型熒光定量 PCR儀，SYBR Green熒光染料(TaRaKa公司，美國)為PCR反應原料，利用Prime 5及DNA man 軟件設計定量PCR所需引物，引物序列見表1，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，按照以下程序進行PCR反應：(1) 95 °C 5 min；(2)95 °C 15 s，60 °C 40 s和 72 °C 20 s，共40個循環(huán)。最后以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCT方法計算相對差異表達的倍數(shù)。

表1 定量PCR引物

1.4 差異性基因信號通路分析 京都基因與基因組(Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)是系統(tǒng)分析基因及其編碼產(chǎn)物間關系、基因功能和基因信息的數(shù)據(jù)庫[10]，把目標基因參與的信號通路進行分析，得到具有顯著性富集的信號通路。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 小鼠差異性表達LncRNA 與0 d比較，變化倍數(shù)超過2倍視為差異性基因。本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后1 d差異性基因的數(shù)目并未有明顯增加，損傷后3 d，差異性基因數(shù)目有較明顯的增加，損傷后7 d，差異性基因數(shù)目出現(xiàn)了明顯增加，損傷后21 d，差異性基因數(shù)目較第7天明顯減少回落(見表2)。差異性基因隨時間變化出現(xiàn)的差異性表達見圖1。

表2 差異性表達LncRNA數(shù)目變化

2.2 熒光定量PCR驗證實驗 對8個神經(jīng)系統(tǒng)特異性LncRNA(NONMMUT052085；NONMMUT038925；NONMMUT06711；NONMMUT051225；NONMMUT005924；NONMMUT070015；NONMMUT021928和NONMMUT061607)進行定量PCR反應，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見表3)，定量PCR實驗驗證芯片結果較可靠。

2.3 差異性基因信號通路分析 利用KEGG數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)差異性基因涉及神經(jīng)配體受體信號通路、PI3K-AKT信號通路、黏附斑激酶信號通路、生化代謝信號通路、破骨細胞分化因子信號通路及溶酶體信號通路等(見圖2)。

3 討論

脊髓損傷是一個復雜的病理過程，涉及到大量的細胞及分子變化，近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)LncRNA富集在小鼠中樞神經(jīng)，且影響著神經(jīng)的發(fā)育，并且與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關。LncRNA可以在不同層面調(diào)節(jié)編碼基因表達，機制復雜[11]。因此，研究脊髓損傷中LncRNA的差異性表達，有助于我們進一步明確脊髓損傷病理過程。

脊髓損傷動物模型是研究脊髓損傷的主要工具。損傷的可重復性是脊髓損傷動物模型是否可靠的重要特征，研究表明，MASCIS碰撞儀可以產(chǎn)生脊髓損傷經(jīng)典模型[12]。早前研究發(fā)現(xiàn)，脊髓在受到原發(fā)性損傷主要是機械力對脊髓的直接損傷，導致了神經(jīng)細胞的死亡及大量丟失。隨之而來的是繼發(fā)性損傷，主要是微血管再灌注損傷、氧自由基產(chǎn)生、脂質過氧化及離子紊亂，易導致神經(jīng)細胞凋亡[13]。本研究表明在脊髓損傷7 d后，細胞和分子改變達到最高峰。通過對不同時間點損傷小鼠脊髓提取總RNA和正常小鼠脊髓提取總RNA，分別予以Affaystar Mouse LncRNA Expression Micraoarray 芯片進行雜交，通過熒光值反映表達量的方法進行比較得出差異性表達LncRNA，通過對不同時間點差異性表達LncRNA數(shù)目分析，在損傷后7 d，LncRNA差異性表達達到最大。提示LncRNA在脊髓損傷后7 d發(fā)揮作用達到頂峰。通過對差異性基因所在信號通路分析，有助于把基因及表達信息作為一個整體網(wǎng)絡進行研究。其中富集值越大，代表差異性基因涉及該信號通路越密切。對差異性基因信號通路分析可以發(fā)現(xiàn)涉及通路較多，神經(jīng)配體受體信號通路是神經(jīng)系統(tǒng)行使功能所涉及的重要通路，該通路包含了許多離子交換及神經(jīng)遞質釋放等，表明LncRNA參與神經(jīng)功能的行使，LncRNA與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關一致。通過KEGG數(shù)據(jù)庫可以發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT信號通路有許多功能，其主要涉及到細胞生長、發(fā)育及凋亡相關。研究表明脊髓損傷后PI3K-AKT信號通路激活有助于神經(jīng)軸突生長[14]。LncRNA參與該信號通路進而參與脊髓損傷后神經(jīng)修復是下一步研究重點。

表3 定量PCR驗證芯片結果可靠性比較

NONMMUT005924GAPDH△CTNONMMUT070015GAPDH△CT NONMMUT021928GAPDH△CT NONMMUT061607GAPDH△CT 對照組25.14±1.5221.48±1.093.66±0.43 26.78±1.6722.54±1.264.24±0.41 24.69±0.9221.49±1.643.20±0.72 26.15±1.0522.16±1.343.99±0.29 1d27.18±1.4122.46±1.674.72±0.26**27.48±0.9121.49±0.835.99±0.08**26.88±1.6622.56±1.574.32±0.09**28.08±0.9422.46±0.875.62±0.07**3d27.85±1.5722.69±1.055.16±0.52**27.57±1.8422.15±1.095.42±0.75**27.29±1.0722.67±1.194.62±0.12**29.78±1.1221.68±1.088.10±0.04**7d27.78±1.0822.49±0.915.29±0.17**27.17±0.9221.58±1.165.58±0.24**27.45±0.9723.15±0.914.30±0.06**29.94±1.0822.49±0.937.45±0.15**21d26.68±1.0622.57±0.934.11±0.13 27.88±1.0522.16±1.175.72±0.12**26.78±1.5722.16±1.494.62±0.08**27.49±1.0721.49±0.826.00±0.25**F12.71 8.48 9.372.69P<0.01 <0.01 <0.01<0.01MS組內(nèi) 0.114 0.162 0.1100.035

綜上所述，在小鼠脊髓損傷模型中LncRNA出現(xiàn)差異性表達，表明LncRNA參與脊髓損傷病理過程，通過對差異性基因所涉及的信號通路改變，我們推測LncRNA參與了脊髓損傷后神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂及神經(jīng)細胞生長凋亡，具體機制仍需進一步研究。

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(本文編輯 劉璐)

Expression profile of LncRNA in spinal cord injury mice

DING Ya,LIU Jin-bo

(DepartmentofOrthopedics,TheThirdAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,ChangzhouJiangsu213000,China)

Objective:To investigate the expression profiles of differential long non-coding RNA(LncRNA) in spinal cord injury mice.Methods:The spinal cord injury mice model were established using MASCIS Impactor weight-drop device,and divided into the 1 d,3 d,7 d and 21 d groups according to the time of harvesting the injured spinal cord.The total RNA was extracted from the injured spine cord,which was used to RNA hybridization using microarray for constructing the different expression profile.The specific LncRNA of nerve tissue was validated by quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR) to verify the reliability of the microarray.The signal pathway involved in the differential LncRNA was analyzed.Results:The differential expression of LncRNA was identified after the spinal cord injury,the expression of which arrived at the highest after 7 days of injury.The result of qRT-PCR showed that the reliability of microarray was good,and the differential LncRNA was involved in sevel signaling pathways.Conclusions:The LncRNA expression in the pathologic process is different after the spinal cord injury

spinal cord injury;long non-coding RNA;signal pathway;mouse

2016-02-18

國家自然科學基金資助項目(81471263)；江蘇省自然科學基金資助項目(BK20151177)

蘇州大學附屬第三醫(yī)院 骨科，江蘇 常州 213000

丁 亞(1991-)，男，碩士研究生.

劉錦波，博士研究生導師，教授.E-mail：czljbljb@126.com

1000-2200(2016)12-1541-04

R 651.2

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.12.001