趙 遠(yuǎn) 谷 娜# 李 恒 謝倩婷 吳云霞 秦會(huì)會(huì)

(1.河北科技大學(xué)理學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省藥用分子化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050018；3.河北省藥物化工工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018)

從20世紀(jì)80年代以來(lái)，全國(guó)各地的湖泊出現(xiàn)了不同程度的水質(zhì)富營(yíng)養(yǎng)化問題[1]。湖泊富營(yíng)養(yǎng)化的直接后果就是導(dǎo)致藍(lán)藻暴發(fā)，引發(fā)水華[2]，降低水資源利用效能，引起嚴(yán)重的生態(tài)破壞及巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。水華發(fā)生時(shí)，藻類物質(zhì)浮在水體表面，形成浮渣，水體透明度下降，溶解氧降低，使整個(gè)水體生態(tài)平衡發(fā)生改變，對(duì)水生生物、人類健康、旅游業(yè)、沿岸的景觀產(chǎn)生威脅[4]。

近些年，光催化技術(shù)開始用于藍(lán)藻治理[5]1934，[6]，[7]457。光催化半導(dǎo)體金屬氧化物產(chǎn)生的·OH可以氧化藻細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，破壞藻細(xì)胞的胞囊，引起藻細(xì)胞解體[5]1937。Cu2O是一種重要的p型半導(dǎo)體材料，禁帶寬度約為2.0 eV，在可見光區(qū)的吸收系數(shù)較高[8]，能在可見光激發(fā)下催化降解有機(jī)物[9]，而目前使用Cu2O光催化降解藻類物質(zhì)的研究還鮮有報(bào)道。

銅綠微囊藻在我國(guó)富營(yíng)養(yǎng)化水體中占據(jù)一定優(yōu)勢(shì)，是引起藍(lán)藻水華的特征藻種[10]。本研究以銅綠微囊藻為研究對(duì)象，采用溶劑熱法制備亞微米Cu2O微球，并研究該微球在可見光作用下去除銅綠微囊藻的性能，考察了其在可見光作用下去除藻細(xì)胞和藻細(xì)胞內(nèi)含物的效果以及對(duì)藻類生長(zhǎng)和藻細(xì)胞活性的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器

材料：銅綠微囊藻，購(gòu)自中科院水生生物研究所，編號(hào)為FACHB-942；乙酸銅、乙二醇、無(wú)水乙醇、葡萄糖、氫氧化鈉、Cu2O、NaNO2、考馬斯亮藍(lán)、牛血清白蛋白、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、抗壞血酸。實(shí)驗(yàn)中使用的化學(xué)試劑均為分析純。

儀器：人工氣候箱(MGC-300H)、生物顯微鏡(DMS600)、紫外—可見分光光度計(jì)(TU-1810PC)、低速臺(tái)式離心機(jī)(TDZ5-WS)、高速冷凍離心機(jī)(GL-21M)、超凈工作臺(tái)(SW-CJ)、高壓滅菌鍋(YX-280A)、光化學(xué)反應(yīng)儀、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(Scientz-Ⅱ)、溶解氧檢測(cè)儀(美國(guó)HACH)、透射電子顯微鏡(TEM)(JEM-2100，日本JEOL)、X射線衍射(XRD)儀(SmartLab系列，日本Rigaku)、原子吸收光譜儀(AAS-100，美國(guó)Perkin Elmer)。

1.2 藻的培養(yǎng)及預(yù)處理

用BG-11培養(yǎng)基，在人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度控制在(24±1) ℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光暗比12 h∶12 h。實(shí)驗(yàn)所用儀器和配制的液體培養(yǎng)基均經(jīng)過(guò)120 ℃的高溫高壓滅菌。在超凈工作臺(tái)中接種銅綠微囊藻，然后置于人工氣候箱中培養(yǎng)。當(dāng)銅綠微囊藻生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)，離心收取藻細(xì)胞，棄去上清液，再用去離子水配制成一定濃度的藻懸液(2.81×107個(gè)/mL)，此濃度高于水華發(fā)生時(shí)水體中的藻細(xì)胞濃度(4.78×106個(gè)/mL)[11-12]。

1.3 Cu2O的制備

Cu2O的制備參考ZHANG等[13]337的方法，并進(jìn)行了改進(jìn)，具體操作如下：取1.0 g乙酸銅，溶解于10 mL去離子水、20 mL乙二醇、50 mL無(wú)水乙醇的混合溶液中，水浴加熱至80 ℃，加入1.4 g氫氧化鈉繼續(xù)攪拌30 min，加入1.2 g葡萄糖反應(yīng)3～4 min，冷卻至室溫，離心過(guò)濾，固體在70 ℃真空干燥5 h即得Cu2O。

1.4 除藻實(shí)驗(yàn)

在50 mL藻懸液中加入不同量的Cu2O，在光化學(xué)反應(yīng)儀(300 W，氙燈)中模擬可見光下的除藻實(shí)驗(yàn)。放置燈管的冷阱外夾層填充2 mol/L的NaNO2溶液，以濾去波長(zhǎng)<400 nm的紫外光，同時(shí)以未投加Cu2O的藻液作為空白對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，取樣進(jìn)行藻生理指標(biāo)的測(cè)定。在黑暗條件下，采用相同用量的藻液和Cu2O進(jìn)行除藻實(shí)驗(yàn)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。將反應(yīng)后的藻液靜置30 min，于液面下3 cm取樣，測(cè)定葉綠素a濃度(采用乙醇萃取法[14])。

1.5 藻類的去除率計(jì)算方法

藻類的去除率以葉綠素a的去除率表征，計(jì)算如下[15]：

η=(1-c/c0)×100%

(1)

式中：η為葉綠素a的去除率，%；c0、c分別為實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)后樣品的葉綠素a質(zhì)量濃度，μg/L。

1.6 藻類生理指標(biāo)測(cè)定方法

可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，參考BRADFORD[16]采用的方法進(jìn)行；丙二醛(MDA)的含量采用硫代巴比妥酸法，參考UCHIYAMA等[17]采用的方法進(jìn)行；藻細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝活性以藻細(xì)胞的光合放氧速率和呼吸耗氧速率表示，采用改良后的黑白瓶法[7]458，[18]測(cè)定。

1.7 Cu2+濃度的測(cè)定

采用原子吸收法測(cè)定體系中Cu2+濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 亞微米Cu2O微球的微觀表征

圖1(a)為制備的亞微米Cu2O微球的XRD圖，其在29.7°、36.7°、42.7°、61.6°和73.9°出現(xiàn)5個(gè)衍射峰，分別歸屬于立方相Cu2O的(110)、(111)、(200)、(220)和(311)晶面衍射[13]338。該XRD圖中未出現(xiàn)Cu、CuO等的XRD特征峰，說(shuō)明合成的Cu2O晶體很純[19]。采用Debye-Scherrer方程，根據(jù)(111)晶面衍射峰計(jì)算Cu2O納米粒子的平均粒徑為10 nm。

圖1(b)、圖1(c)、圖1(d)為制備的Cu2O的TEM圖及電子衍射圖。由圖1(b)可以看出，制備的亞微米Cu2O微球具有較均一的形態(tài)，尺寸分布在400～500 nm；由圖1(c)可以觀察到Cu2O的晶格條紋，晶格間距為0.26 nm，對(duì)應(yīng)Cu2O(111)晶面[20]；圖1(c)還可看出，單個(gè)Cu2O納米粒子的粒徑為10 nm左右，說(shuō)明亞微米Cu2O微球是由粒徑10 nm左右的Cu2O納米粒子聚集而成；圖1(d)可以看到，Cu2O有明顯的(110)、(111)、(200)、(220)和(311)晶面衍射條紋。

2.2 Cu2O去除銅綠微囊藻的性能

2.2.1 藻類的去除率

葉綠素a的變化是表征除藻效果的重要參數(shù)。圖2為在可見光及黑暗條件下加入不同量的Cu2O作用3 h后銅綠微囊藻的葉綠素a去除率。由圖2可以看出，未添加Cu2O時(shí)，可見光照射3 h和黑暗條件下放置3 h，銅綠微囊藻的葉綠素a去除率為5.2%和1.3%，說(shuō)明短時(shí)間可見光照射或黑暗條件下放置對(duì)銅綠微囊藻的影響較小。當(dāng)銅綠微囊藻中加入Cu2O時(shí)，在黑暗條件下，葉綠素a去除率隨Cu2O加入量的增加而增加，當(dāng)Cu2O加入量達(dá)到0.5 g/L時(shí)，葉綠素a去除率為49.3%。在黑暗條件下，加入Cu2O后，銅綠微囊藻葉綠素a的降低可能是由于亞微米Cu2O微球?qū)︺~綠微囊藻細(xì)胞的吸附絮凝作用產(chǎn)生的，也可能是由于Cu2O溶解釋放Cu2+[21]對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)活性產(chǎn)生影響[22]。在可見光下，葉綠素a去除率隨Cu2O加入量的增加而增加，高于黑暗條件下的去除率，當(dāng)Cu2O加入量達(dá)到0.4 g/L時(shí)，葉綠素a去除率為80.4%，說(shuō)明在可見光作用下，Cu2O受到激發(fā)，產(chǎn)生光催化降解藻細(xì)胞的作用；當(dāng)Cu2O加入量達(dá)到0.5 g/L時(shí)，葉綠素a去除率反而有所下降，這可能是由于催化劑用量過(guò)大會(huì)影響光催化反應(yīng)時(shí)催化劑吸收光的能力，進(jìn)而影響光催化反應(yīng)的效率。

圖1 Cu2O的XRD圖和TEM圖Fig.1 XRD pattern and TEM images of Cu2O

圖2 銅綠微囊藻的葉綠素a去除率Fig.2 Chlorophyll a removal rate of Microcystis aeruginosa

2.2.2 可溶性蛋白

圖3為在可見光及黑暗條件下加入不同量的Cu2O作用3 h后銅綠微囊藻藻液的可溶性蛋白含量的變化。在可見光和黑暗條件下，與初始藻液的可溶性蛋白(120.2 mg/L)相比，不添加Cu2O時(shí)，可溶性蛋白含量變化不大，說(shuō)明短時(shí)間可見光照射或黑暗放置對(duì)銅綠微囊藻影響不大。在黑暗條件下，加入不同量的Cu2O時(shí)，銅綠微囊藻的可溶性蛋白含量緩慢下降，說(shuō)明在黑暗條件下，Cu2O對(duì)藻細(xì)胞的活性有一定影響，這可能是由于Cu2O溶解產(chǎn)生的少量Cu2+具有殺藻作用造成的。在可見光下，加入Cu2O后，銅綠微囊藻藻液的可溶性蛋白含量大幅下降，說(shuō)明Cu2O的光催化作用可以降解藻細(xì)胞內(nèi)含物。并且可見光下加入Cu2O后的可溶性蛋白含量低于黑暗條件下加入等量Cu2O時(shí)的可溶性蛋白含量，說(shuō)明Cu2O的光催化產(chǎn)生了更強(qiáng)的抑藻作用。另外，由圖3還可以看出，隨Cu2O加入量的增加，可溶性蛋白含量減少，加入量為0.4 g/L時(shí)，可溶性蛋白含量最低，這種變化與葉綠素a去除率變化規(guī)律一致。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究銅綠微囊藻的其他生長(zhǎng)指標(biāo)時(shí)，Cu2O加入量均為0.4 g/L。

圖3 銅綠微囊藻的可溶性蛋白變化Fig.3 Concentration variation of total soluble protein in Microcystis aeruginosa

2.2.3 細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化

MDA是不飽和脂肪酸過(guò)氧化產(chǎn)物之一，其濃度可用作藻細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)，體系中MDA濃度增加，說(shuō)明藻細(xì)胞膜受到破壞。圖4為可見光和黑暗條件下添加0.4 g/LCu2O不同時(shí)間后藻液中MDA濃度變化。由圖4可以看出，在可見光下，隨光催化反應(yīng)時(shí)間的增加，MDA濃度不斷增加；當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到2 h時(shí)，MDA濃度達(dá)到最大值；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)2 h以后，銅綠微囊藻MDA濃度下降。這主要是因?yàn)殡S反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，藻細(xì)胞膜破壞釋放出來(lái)的MDA繼續(xù)被Cu2O光催化作用產(chǎn)生的活性自由基氧化，導(dǎo)致MDA濃度減少。在黑暗條件下，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，MDA濃度逐漸增加，說(shuō)明Cu2O本身對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞的細(xì)胞膜有一定破壞作用，但MDA濃度低于可見光下的MDA濃度，說(shuō)明在光輔助下Cu2O對(duì)藻細(xì)胞膜的破壞作用較強(qiáng)，Cu2O的光催化作用促進(jìn)了藻細(xì)胞的深度降解。

圖4 銅綠微囊藻MDA變化Fig.4 MDA variation of Microcystis aeruginosa

2.2.4 藻細(xì)胞的光合放氧速率和呼吸耗氧速率

表1為實(shí)驗(yàn)中銅綠微囊藻的光合放氧速率和呼吸耗氧速率。由表1可知，經(jīng)過(guò)0.4 g/L Cu2O光催化處理3 h后，銅綠微囊藻的光合放氧速率和呼吸耗氧速率遠(yuǎn)低于未加入光催化劑時(shí)的對(duì)照組，說(shuō)明Cu2O光催化處理后，銅綠微囊藻光合作用能力和代謝活性降低，銅綠微囊藻的生長(zhǎng)受到抑制。

表1 光合放氧速率和呼吸耗氧速率

2.2.5 藻細(xì)胞形態(tài)

圖5為處理前后銅綠微囊藻的細(xì)胞形態(tài)。由圖5(a)可以看出，銅綠微囊藻細(xì)胞呈現(xiàn)球形；由圖5(b)可以看出，部分藻體細(xì)胞發(fā)生變形，不再是球形，說(shuō)明Cu2O的光催化作用破壞了藻細(xì)胞的形態(tài)。

2.2.6 Cu2+濃度

上述分析表明，Cu2O在黑暗條件下具有一定去除銅綠微囊藻的作用，這可能是Cu2O部分溶解產(chǎn)生Cu2+，因此本研究測(cè)定了在黑暗條件下銅綠微囊藻藻液中剛加入Cu2O后及作用3 h后體系中Cu2+濃度，如圖6(a)所示。由圖6(a)可知，在黑暗條件下加入Cu2O后，體系中Cu2+濃度隨Cu2O加入量增加而增加，當(dāng)Cu2O質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí)，Cu2+質(zhì)量濃度為0.373 mg/L，說(shuō)明確實(shí)有少量的Cu2O溶解產(chǎn)生Cu2+，因此在黑暗條件下，Cu2O也會(huì)產(chǎn)生一定抑藻作用。體系中加入Cu2O 3 h后，Cu2O的質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí)，體系中殘留Cu2+質(zhì)量濃度為0.092 mg/L，低于《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB 8978—1996)總銅限值(0.5 mg/L)，因此使用Cu2O除藻相對(duì)安全。圖6(b)為0.5 g/LCu2O水溶液中24 h內(nèi)Cu2+濃度隨時(shí)間的變化。由圖6(b)可以看出，加入0.5 g/LCu2O的水體中Cu2+質(zhì)量濃度在0.4 mg/L以下，低于GB 8978—1996中總銅限值，因此使用Cu2O去除水體中藻類不會(huì)引起Cu2+的殘留問題。

圖5 銅綠微囊藻細(xì)胞形態(tài)Fig.5 Morphology of Microcystis aeruginosa

圖6 加入Cu2O后Cu2+質(zhì)量濃度Fig.6 Concentration of Cu2+ after adding Cu2O

圖7 Cu2O的循環(huán)使用Fig.7 Recycle of Cu2O

2.2.7 Cu2O的穩(wěn)定性

將Cu2O從藻液中分離出來(lái)，用去離子水洗滌干燥后，再次進(jìn)行可見光下的去除銅綠微囊藻的實(shí)驗(yàn)，葉綠素a去除率如圖7(a)所示。由圖7(a)可以看出，經(jīng)過(guò)3次循環(huán)使用，銅綠微囊藻的葉綠素a去除率僅有少量降低。圖7(b)為經(jīng)過(guò)3次循環(huán)使用后Cu2O的XRD圖，圖中Cu2O的(110)、(111)、(200)、(220)和(311)衍射峰仍然存在，說(shuō)明亞微米Cu2O微球具有很好的穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

(1) 采用溶劑熱法制備了由10 nm左右的納米Cu2O顆粒聚集成的直徑在400～500 nm的亞微米Cu2O微球。

(2) 亞微米Cu2O微球在可見光下具有較好的光催化降解銅綠微囊藻的效果，當(dāng)Cu2O加入量為0.4 g/L時(shí)，3 h后葉綠素a去除率可達(dá)80.4%。

(3) 亞微米Cu2O微球的光催化作用可以破壞藻細(xì)胞膜，深度降解藻細(xì)胞內(nèi)含物，降低藻細(xì)胞的代謝活性，阻止銅綠微囊藻的生長(zhǎng)。

[1] 秦伯強(qiáng)，王小冬.太湖富營(yíng)養(yǎng)化與藍(lán)藻水華引起的飲用水危機(jī)——原因與對(duì)策[J].地球科學(xué)進(jìn)展，2007，22(9)：896-960.

[2] BEAULIEU S E，SENGCO M R，ANDERSON D M.Using clay to control harmful algal blooms: deposition and resuspension of clay/algal flocs[J].Harmful Algae，2005，4(1)：123-138.

[3] 李靜會(huì)，高偉，張衡，等.除藻劑應(yīng)急治理玄武湖藍(lán)藻水華實(shí)驗(yàn)研究[J].環(huán)境污染與防治，2007，29(1)：60-62.

[4] ZOU Hua，PAN Gang，CHEN Hao，et al.Removal of cyanobacterial blooms in Taihu Lake using local soils.Ⅰ. Effective removal ofMicrocystisaeruginosausing local soils and sediments modified by chitosan[J].Environmental Pollution，2006，141(2)：201-205.

[5] 尹海川，林強(qiáng)，柳清菊，等.納米TiO2摻雜貴金屬Pt抑制藍(lán)藻的生長(zhǎng)[J].功能材料，2005，36(12).

[6] YU Xiaojuan，ZHOU Jiangya，WANG Zhiping，et al.Preparation of visible light-responsive AgBiO3bactericide and its control effect on theMicrocystisaeruginosa[J].Journal of Photochemistry and Photobiology B：Biology，2010，101(3)：265-270.

[7] 廖興盛，汪星，趙開弘，等.UV-C光催化納米TiO2對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)影響的研究[J].武漢植物學(xué)研究，2007，25(5).

[8] LI Jiangying，XIONG Shenglin，PAN Jun，et al.Hydrothermal synthesis and electrochemical properties of urehin-like core-shell copper (Ⅰ) oxide nanostruetures[J].J. Phys. Chem. C，2010，114(21)：9645-9650.

[9] 張文蓉，孫家壽，陳金毅，等.累托石/氧化亞銅納米復(fù)合材料的制備及光催化性能研究[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2011，5(4)：956-960.

[10] 李娟，王應(yīng)軍，高鵬.過(guò)氧化氫對(duì)銅綠微囊藻的損傷效應(yīng)研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2015，35(4)：1183-1189.

[11] 鄒華，潘綱，陳灝.殼聚糖改性粘土對(duì)水華優(yōu)勢(shì)藻銅綠微囊藻的絮凝去除[J].環(huán)境科學(xué)，2004，25(6)：40-43.

[12] 張普，董利英，喬俊蓮，等.改性粉煤灰對(duì)銅綠微囊藻的去除效果及影響因素研究[J].水處理技術(shù)，2015，41(1)：56-60.

[13] ZHANG Zailei，CHEN Han，SHE Xilin，et al.Synthesis of mesoporous copper oxide microspheres with different surface areas and their lithium storage properties[J].Journal of Power Sources，2012，217.

[14] 國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》編委會(huì).水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法[M].4版.北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，2002：670.

[15] 尋濤.高錳酸鉀預(yù)氧化復(fù)合礦物質(zhì)與PAC混凝去除水中顫藻的研究[D].青島：青島科技大學(xué)，2009.

[16] BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72(1/2)：248-254.

[17] UCHIYAMA M，MIHARA M.Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbitaric acid test[J].Analytical Biochemistly，1978，86(1)：271-278.

[18] WINKLER M，HEMSCHEMEIER A，GOTOR C，et al.[Fe]-hydrogenases in green algae: photo-fermentation and hydrogen evolution under sulfur deprivation[J].International Journal of Hydrogen Energy，2002，27(11/12)：1431-1439.

[19] 曾建強(qiáng)，王莉，譚一良，等.Cu2O亞微米空心球的低共熔溶劑輔助合成與表征[J].化學(xué)通報(bào)，2015，78(1)：63-67.

[20] 馬麗麗，余穎，黃文婭，等.多元醇法制備Cu2O/CNTs復(fù)合材料的研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2005，63(18)：1641-1645.

[21] SUNADA K，MINOSHIM M，HASHIMOTO K.Highly efficient antiviral and antibacterial activities of solid-state cuprous compounds[J].Journal of Hazardous Materials，2012，235/236：265-270.

[22] 晉利，李曉亮.Cu2+對(duì)銅銹微囊藻生長(zhǎng)及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊慬J].植物生理學(xué)報(bào)，2015，51(2)：178-182.