李鳳梅 郭書海 張燦燦 張玲妍 楊雪蓮

(1.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110016；2.沈陽大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110044)

多環(huán)芳烴(PAHs)是焦化場(chǎng)地土壤中主要的污染物之一，主要來源于煤的不完全燃燒及焦油、煤氣等化工產(chǎn)品的加工過程，因其穩(wěn)定性好、疏水性強(qiáng)，可長期吸附在土壤顆粒中而難以降解[1-3]。CANET等[4]曾報(bào)道國外某焦化廠的土壤中16種PAHs質(zhì)量濃度總和為423 mg/kg。加利福尼亞某人造煤氣工廠的土壤中PAHs質(zhì)量濃度達(dá)到2 484 mg/kg[5]。馮嫣等[6]報(bào)道北京某廢棄焦化廠的土壤中PAHs質(zhì)量濃度達(dá)144.8 mg/kg，土壤表層聚集了大量3、4環(huán)PAHs。PAHs為有毒物質(zhì)，具有極強(qiáng)的致癌、致畸及致突變作用[7-8]。焦化場(chǎng)地土壤中的PAHs可通過揚(yáng)塵及地表徑流進(jìn)入生物體和沉積物中，對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境造成危害。因此，焦化場(chǎng)地PAHs污染土壤的修復(fù)已成為亟待解決的問題。

微生物修復(fù)是降解土壤中PAHs的主要途徑，微生物修復(fù)對(duì)PAHs的降解效果受多種因素影響，如營養(yǎng)物質(zhì)含量、氧含量、pH、降解菌種類和數(shù)量、污染物的生物有效性等，其中降解菌種類和數(shù)量對(duì)PAHs降解率的影響較大。向土壤施加外源高效PAHs降解菌能直接改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，增加土壤PAHs降解菌數(shù)量和活性，是一種具有針對(duì)性的微生物原位修復(fù)手段[9-15]。迄今為止，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)降解PAHs的微生物進(jìn)行了廣泛研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的能夠降解PAHs的微生物有70多個(gè)屬200余種[16]。但在實(shí)際應(yīng)用中，由于污染物性質(zhì)、土壤成分不同，且土壤中的土著微生物可能會(huì)對(duì)外源微生物的生長造成抑制，導(dǎo)致外源微生物對(duì)PAHs的降解率偏低。因此，有必要針對(duì)污染土壤的特點(diǎn)進(jìn)行微生物的篩選，進(jìn)而提高PAHs降解率。

沈陽某焦化廠由于老廠搬遷，場(chǎng)地遺留大量的污染土壤，PAHs濃度大，且中環(huán)(4、5環(huán))PAHs所占的比例較高，在土地重新利用之前，必須進(jìn)行土壤修復(fù)。本研究以該焦化場(chǎng)地污染土壤為研究材料，進(jìn)行PAHs降解菌富集、篩選和鑒定，并實(shí)施微生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)。研究成果對(duì)焦化場(chǎng)地受PAHs污染土壤的微生物修復(fù)具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 污染土壤采集

污染土壤采自沈陽某焦化廠受PAHs污染的表層(0～10 cm)土壤，除去石塊后過10目篩，放入自封袋中，封口，4 ℃保存。對(duì)污染土壤進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定，取平均值，得出其基本理化性質(zhì)為：pH 8.34、含水率18.9%、有機(jī)碳26.30 g/kg、總氮1.56 g/kg、總磷3.12 g/kg。PAHs質(zhì)量濃度總和為5 672.00 mg/kg，檢出的13種PAHs均為美國環(huán)境保護(hù)署(USEPA)優(yōu)先控制PAHs，各種PAHs的質(zhì)量濃度及質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。土壤中以中環(huán)PAHs為主，占PAHs總和的75.21%。

1.2 培養(yǎng)基配制

無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制參見《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[17]84-86。

無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基：在無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入15 g瓊脂粉。

血平板培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基于121 ℃下滅菌20 min，冷卻至50 ℃后加入5%(體積分?jǐn)?shù))無菌脫纖維綿羊血，搖勻后傾倒平板。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

PAHs降解菌的富集、分離和純化：稱取10 g污染土壤加入50 mL已滅菌的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，在搖床中于30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)5 d；靜置1 h后取上清液1 mL，接入裝有20 g污染土壤的50 mL已滅菌無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)5 d；循環(huán)2次。取循環(huán)培養(yǎng)2次后的上清液1 mL，采用稀釋平板法在無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，其中PAHs質(zhì)量濃度總和為500 mg/kg，各種PAHs比例與表1相同。培養(yǎng)5 d后，根據(jù)菌落形態(tài)挑取長勢(shì)良好且數(shù)量較多的菌落，將其在含有500 mg/kgPAHs的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線培養(yǎng)，直至得到單一菌落，純化后的菌株保存于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面中。

表1 污染土壤中各種PAHs的質(zhì)量濃度及質(zhì)量分?jǐn)?shù)

注：1)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，表2、表3同。

PAHs降解菌的篩選：利用初步降解實(shí)驗(yàn)進(jìn)行PAHs降解菌的篩選。將純化的菌株培養(yǎng)后用無菌生理鹽水分別制成109cfu/mL的菌懸液。稱取污染土壤10 g，溶于20 mL已滅菌的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，配成污染土壤泥漿；在無菌條件下，取菌懸液2 mL接種于污染土壤泥漿中，并分別作加氯化汞滅菌和不滅菌2種對(duì)照。每種處理做3個(gè)重復(fù)，在搖床中于30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)15 d，測(cè)其PAHs濃度，篩選出PAHs總降解率較高的菌株。

表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選：利用血平板實(shí)驗(yàn)進(jìn)行表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選。分別挑取活化的PAHs降解菌點(diǎn)接于血平板培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)24 h。若有溶血圈出現(xiàn)，證明該菌株能產(chǎn)生表面活性劑。

微生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)：稱取污染土壤2 kg，將篩選的菌株經(jīng)活化后制成菌懸液接種到土壤中混勻，混勻后土壤菌落數(shù)為108cfu/g。為了與原土壤環(huán)境相近，土壤含水率基本保持在20%左右，微生物修復(fù)在自然條件下進(jìn)行。在相同條件下與未接種菌株的土壤做對(duì)照，在培養(yǎng)10、20、30、40、60 d時(shí)分別取樣。

1.4 分析方法

PAHs測(cè)定：PAHs提取參照《水質(zhì) 多環(huán)芳烴的測(cè)定 液液萃取和固相萃取高效液相色譜法》(HJ 478—2009)[18]和USEPA推薦的超聲萃取法[19]。采用Waters 1525高效液相色譜儀測(cè)定PAHs濃度。色譜柱為Waters Symmetry C18分離柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，測(cè)定過程中，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，流速為1 mL/min，流動(dòng)相為乙腈和水。用保留時(shí)間和峰高，配合PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)液為外標(biāo)定量計(jì)算PAHs濃度。

菌株鑒定：參考《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[17]54-59和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[20]對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行形態(tài)觀察，16S rRNA基因序列由上海某生物技術(shù)有限公司測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果與美國國立生物信息技術(shù)中心(NCBI)Genbank數(shù)據(jù)庫中的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，根據(jù)形態(tài)觀察及同源性比對(duì)結(jié)果鑒定到屬。

2 結(jié)果與討論

2.1 PAHs降解菌篩選

經(jīng)富集、分離和純化，從焦化場(chǎng)地污染土壤中共獲得7株菌株，記為B1～B7。B1～B7在含PAHs的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中均能生長。對(duì)純化后的菌株進(jìn)行初步降解實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其對(duì)PAHs的總降解率，結(jié)果見表2。由表2可以看出，經(jīng)15 d降解后，B1～B7均具有一定的PAHs降解能力，但對(duì)PAHs的降解能力存在差異，PAHs總降解率平均值最高可達(dá)到44.3%，最低為26.1%。接種B4、B5和B7后，PAHs總降解率分別為41.7%、44.3%、42.8%，均達(dá)到40%以上，因此本研究將B4、B5和B7篩選為高效PAHs降解菌。

2.2 表面活性劑產(chǎn)生菌篩選

由于表面活性劑具有降低表面張力的作用，可使血平板中的紅細(xì)胞破裂并釋放血紅素，導(dǎo)致血平板上出現(xiàn)溶血圈，因此本研究采用血平板實(shí)驗(yàn)進(jìn)行表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選。將分離得到的B1～B7點(diǎn)接于血平板培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)24 h后測(cè)量溶血圈直徑并記錄結(jié)果。B2和B7產(chǎn)生了溶血圈，B2的溶血圈直徑明顯大于B7(見表2)，并且連續(xù)轉(zhuǎn)接后性狀穩(wěn)定。因而，將B2篩選為高效表面活性劑產(chǎn)生菌。

2.3 不同處理?xiàng)l件對(duì)比

B2為高效表面活性劑產(chǎn)生菌，能向環(huán)境中釋放表面活性劑，降低疏水性污染物表面張力，促進(jìn)微生物吸收和代謝PAHs，從而加速PAHs的降解[21],[22]891,[23]。因此，將B2分別與B4、B5、B7等質(zhì)量混合，接種于污染土壤泥漿中，在搖床中于30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)9 d，比較PAHs總降解率。

表2 PAHs總降解率和溶血圈直徑

表3展示了不同處理?xiàng)l件下PAHs總降解率隨時(shí)間的變化。由表3可以看出，加氯化汞滅菌的對(duì)照組PAHs總降解率很低，基本保持在8%左右，這可能是PAHs揮發(fā)或被瓶壁吸附造成。不滅菌的對(duì)照組PAHs總降解率隨時(shí)間的延長逐漸增加，在9 d時(shí)平均值達(dá)到26.4%，說明污染土壤中存在的土著微生物可能對(duì)PAHs有一定的降解作用。接種菌株后，在3 d時(shí)的PAHs總降解率平均值為21.0%～31.0%，明顯高于對(duì)照組，說明部分PAHs被PAHs降解菌所利用。在9 d時(shí)不同菌株對(duì)PAHs的總降解率表現(xiàn)為：B4+B2>B5>B5+B2>B7+B2>B7>B4>B2，說明添加B2總體上能提高PAHs總降解率，其中接種B4+B2后，PAHs總降解率平均值在9 d時(shí)達(dá)到45.9%。其原因可能是表面活性劑提高了PAHs的生物有效性，這與前人的研究結(jié)果一致[22]890,[24-25]。

表3 不同處理?xiàng)l件下PAHs總降解率隨時(shí)間的變化

2.4 菌株鑒定

采用形態(tài)觀察和16S rRNA基因序列比對(duì)對(duì)B2和B4進(jìn)行鑒定。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，B2的菌落為乳白色、圓形，邊緣規(guī)則，質(zhì)地光滑，表面扁平，革蘭氏染色呈陰性，無芽孢；B4的菌落為灰白色、圓形，不透明，邊緣不規(guī)則呈葉裂狀，質(zhì)地粗糙，表面隆起，革蘭氏染色呈陽性，有芽孢。

利用細(xì)菌16S rRNA基因序列的通用引物F27(基因序列為5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和R1492(基因序列為5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進(jìn)行擴(kuò)增，得到1 400 bp左右的16S rRNA基因序列，進(jìn)行同源性比對(duì)。比對(duì)結(jié)果表明，B2和B4歸為2個(gè)不同的屬。B2與假單胞菌屬(Pseudomonassp.)多個(gè)菌株的基因序列相似性均在99%以上；B4與芽孢桿菌屬(Bacillussp.)多個(gè)菌株的基因序列相似性達(dá)到99%以上。結(jié)合B2和B4的菌落形態(tài)及16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果，可確定B2為假單胞菌屬，B4為芽孢桿菌屬。假單胞菌屬和芽孢桿菌屬是目前發(fā)現(xiàn)的PAHs降解菌種類最多、降解范圍最廣的菌屬，已發(fā)現(xiàn)的菌株不僅可以降解低環(huán)(≤3環(huán))PAHs，還可以降解中環(huán)PAHs[26-27]。

2.5 微生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)

通過微生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究B4+B2在實(shí)際土壤環(huán)境中的PAHs總降解率。實(shí)驗(yàn)組接種B4+B2，對(duì)照組不接種菌株。PAHs總降解率隨時(shí)間的變化如圖1所示。對(duì)照組的PAHs總降解率最高達(dá)28.3%，說明土壤存在的土著微生物能降解PAHs，土壤具有一定的自我修復(fù)能力。實(shí)驗(yàn)組的PAHs總降解率在30 d內(nèi)迅速升高，隨后有所減緩。同一時(shí)間內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組的PAHs總降解率顯著高于對(duì)照組。在60 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的PAHs總降解率達(dá)到最大，為48.1%，高于對(duì)照組近20百分點(diǎn)。

圖1 微生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)中PAHs總降解率隨時(shí)間的變化Fig.1 Total degradation rates of PAHs varied with time in microbial remediation experiment

為進(jìn)一步考察接種B4+B2后對(duì)不同環(huán)數(shù)PAHs降解效果的差別，分別計(jì)算了60 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)13種PAHs的降解率，結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)組3、4、5、6環(huán)PAHs的平均降解率分別為93.9%、54.6%、28.1%、6.3%，低環(huán)PAHs幾乎完全降解，中環(huán)PAHs部分降解，而高環(huán)(≥6環(huán))PAHs較少降解，土壤中13種PAHs隨著環(huán)數(shù)的增加，其降解率逐漸降低。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組對(duì)3、4、5、6環(huán)PAHs的平均降解率分別提高3.8、34.1、25.1、4.4百分點(diǎn)，對(duì)中環(huán)PAHs的平均降解率提高29.6百分點(diǎn)。可見，接種B4+B2提高了土壤中各種PAHs的降解率，對(duì)中環(huán)PAHs的降解率提高最大，對(duì)高環(huán)PAHs的降解率也有較明顯的提高。

微生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，PAHs降解的難易程度不僅與PAHs分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，還與PAHs的物理化學(xué)性質(zhì)和PAHs降解菌的特性有關(guān)。微生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)?zāi)苡行Ы到馕廴就寥乐械牡铜h(huán)PAHs，但對(duì)高環(huán)PAHs降解率較低[28]。高環(huán)PAHs污染土壤修復(fù)的難點(diǎn)之一是高環(huán)PAHs的生物有效性較低；此外，污染土壤中的PAHs降解菌數(shù)量較少也是限制因素。本研究以沈陽某焦化廠高質(zhì)量濃度PAHs(5 672.00 mg/kg)污染土壤為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)接種B2+B4對(duì)污染土壤具有良好的修復(fù)效果，對(duì)中環(huán)PAHs的降解率提高最大，對(duì)高環(huán)PAHs的降解率也有較明顯的提高。研究表明，PAHs降解菌的使用對(duì)焦化場(chǎng)地污染土壤的修復(fù)具有較大的應(yīng)用潛力。

圖2 微生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)中各種PAHs的降解率Fig.2 Degradation rates of individual PAHs in microbial remediation experiment

3 結(jié) 論

(1) 經(jīng)過富集、分離和純化，從沈陽某焦化廠的污染土壤中分離得到7株菌株B1～B7。其中，B4、B5、B7對(duì)PAHs的降解能力較為突出，在15 d時(shí)對(duì)PAHs總降解率分別為41.7%、44.3%、42.8%，為高效PAHs降解菌；B2為高效表面活性劑產(chǎn)生菌。

(2) B2能產(chǎn)生表面活性劑，提高PAHs的生物有效性，使混合菌株對(duì)PAHs的總降解率普遍高于單一菌株。B4+B2為降解PAHs的優(yōu)勢(shì)混合菌株，在9 d時(shí)PAHs總降解率平均值達(dá)到45.9%。經(jīng)形態(tài)觀察和16S rRNA基因序列比對(duì)，鑒定B2和B4分別歸于假單胞菌屬和芽孢桿菌屬。

(3) 接種B2+B4對(duì)污染土壤PAHs的微生物修復(fù)有明顯的強(qiáng)化作用，在60 d時(shí)PAHs總降解率達(dá)到48.1%；對(duì)中環(huán)PAHs降解率的提高尤為明顯，7種中環(huán)PAHs的平均降解率比不接種菌株的對(duì)照組提高29.6百分點(diǎn)。

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