董 浩，牛 慧，彭小薇，王曉英，孫 雨，宋曉暉*

(1.中國動物疫病預防控制中心，北京 102600；2.青島市腫瘤醫(yī)院放療二科，山東青島 266042；3.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

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布魯菌Hfq蛋白研究進展

董 浩1，牛 慧2，彭小薇3，王曉英1，孫 雨1，宋曉暉1*

(1.中國動物疫病預防控制中心，北京 102600；2.青島市腫瘤醫(yī)院放療二科，山東青島 266042；3.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

布魯菌病(布病)是一種嚴重的人獸共患病。作為布病的病原，布魯菌能夠耐受宿主體內的各種殺菌機制并持續(xù)的生存。當布魯菌侵入宿主體內后，必須適應抗體免疫的環(huán)境，而這依賴于布魯菌對自身基因表達的巧妙調控。Hfq蛋白是一個RNA伴侶分子，對于介導sRNA的轉錄后調控發(fā)揮著重要的作用。在多種細菌中，對Hfq蛋白的功能都進行了深入的研究，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該蛋白與細菌基因的表達調控、細菌對多種應激環(huán)境的適應能力以及致病菌的毒力均有著密切的關系。論文對Hfq蛋白的結構，對sRNA的調控功能，特別是布魯菌Hfq蛋白調控功能的研究現(xiàn)狀及在布病疫苗研發(fā)中的應用進行系統(tǒng)的介紹，為布魯菌基因的表達調控和布病防控技術的研究提供參考。

布魯菌；Hfq蛋白；sRNA

Hfq蛋白最早源于大腸埃希菌中鑒定的一個RNA噬菌體Qβ有效復制所需要的宿主因子。隨后由于hfq基因缺失后會引起大腸埃希菌對紫外線、氧化劑、滲透壓的耐受能力降低，并且生長速度也減慢，引起了研究者們極大的興趣?，F(xiàn)在普遍認為在細菌中其作為一個RNA伴侶分子，可以促進RNA的互作從而催化快速且特異的調控反應。研究發(fā)現(xiàn)，Hfq分子除了作為RNA伴侶分子外還可以與DNA分子形成復合體，改變DNA分子雙螺旋結構的力學特性從而使DNA分子固縮。

1 Hfq蛋白

在真核生物、細菌和古生菌中，Hfq蛋白均屬于保守的RNA結合Lsm(like-Sm)/Sm樣蛋白家族成員[1]，其含有一個保守的Sm1基序，能夠形成環(huán)形的結構，可以特異性的結合RNA。Hfq蛋白在溶液狀態(tài)下可以形成同源五聚體或者同源六聚體結構，能夠優(yōu)先與富集A/U的RNA結合[2]。Hfq 能夠通過環(huán)的不同結合表面(近端、遠端和圓周)與sRNA、靶蛋白轉錄單元相互作用，從而能夠幫助sRNA與靶點配對。在環(huán)的近端主要結合sRNA和mRNA 富集A/U的區(qū)域，而在遠端處結合RNA的polyA尾[3]。

隨著越來越多的細菌sRNA被發(fā)現(xiàn)，Hfq蛋白在sRNA介導的基因調控中起到重要的作用正逐步被揭開[2]。在細菌sRNA介導的轉錄后調控中，Hfq蛋白所發(fā)揮的功能可以歸納為以下4個方面：①Hfq蛋白可以保護sRNA免受核糖核酸酶的剪切；②通過與sRNA、mRNA結合增加sRNA的局部濃度，促進sRNA與它們靶mRNA之間的配對；③Hfq蛋白調節(jié)細菌重要的mRNA衰減酶(poly(A)聚合酶，多核苷酸磷酸酶以及核糖核酸酶E24-26)的活性；④Hfq蛋白可以使RNA的3′末端易于多聚腺苷酸化，使得RNA被外切核苷酸的降解從而促進RNA的周轉[4]。

由于Hfq蛋白是sRNA介導的轉錄后調控的中心元件，缺失了hfq基因常常導致多種表型以及毒力顯著降低。研究結果表明hfq基因缺失后會引起多種致病菌(牛種布魯菌、沙門菌、霍亂弧菌、弗朗西斯土拉桿菌[5]、嗜血桿菌[6]、腦膜炎奈瑟菌、阪崎腸桿菌[7]、銅綠假單胞菌、根癌農(nóng)桿菌[8]、腸道病原性大腸埃希菌[9]、鼠疫耶爾森菌、小腸結腸炎耶爾森菌[10]、單核細胞增生性李斯特菌、福氏志賀菌[11]、痢疾志賀菌、嗜肺軍團菌等)在細胞、小鼠以及特定的感染模型中毒力降低[12]。

2 布魯菌Hfq蛋白研究進展

1999年，Robertson G T等[13]發(fā)現(xiàn)了在流產(chǎn)布魯菌中hfq基因缺失后會引起缺失株對于強氧化環(huán)境(H2O2)、酸性環(huán)境(pH 4.0)、營養(yǎng)缺陷環(huán)境的耐受能力降低。崔明全等還發(fā)現(xiàn)羊種布魯菌16M的hfq基因缺失株和親本菌株相比對髙滲透壓環(huán)境(1.5mol/L NaCl)、高溫(50℃)、多黏菌素B的敏感性都增加[14]。除此之外，和親本菌株相比，hfq基因缺失株在巨噬細胞和小鼠感染模型中的生存和增殖能力均顯著降低。2002年Roop R M 等[15]揭示了羊種布魯菌16M的hfq基因缺失株與野生株相比對懷孕羊毒力顯著下降。

隨著分子生物學的發(fā)展，布魯菌Hfq蛋白在布魯菌毒力中所發(fā)揮的重要作用逐步被揭開。2011年Caswell C C等[16]指出在牛種布魯菌2308中，布魯菌的重要毒力因子Ⅳ型分泌系統(tǒng)(由virB操縱子編碼)的表達受到Hfq的影響。在hfq基因缺失株中，virB操縱子的轉錄和翻譯水平均降低。進一步的研究發(fā)現(xiàn)Hfq可能是通過依賴于BabR(布魯菌群體感應調控子，也稱BlxR)和不依賴于BabR兩種不同的途徑對virB操縱子的表達進行調控。此前的研究還發(fā)現(xiàn)牛種布魯菌2308hfq基因缺失株中許多布魯菌的毒力基因表達水平異常，包括編碼周質超氧化物歧化酶的sodC基因[17]、編碼酸性環(huán)境耐受相關蛋白的hdeA基因以及編碼LuxR型轉錄調控子的babR基因[18]。

2013年，崔明全等采用基因芯片的方法對羊種布魯菌16M和hfq基因缺失株在酸性基礎培養(yǎng)基中的轉錄譜進行了研究，表明在該培養(yǎng)條件下羊種布魯菌16M中Hfq蛋白直接或間接影響著多達359個基因(約占布魯菌總基因數(shù)目的11%)的表達，和親本菌株相比，在hfq基因缺失株中194個基因的表達水平下降，而165個基因的表達水平升高。對差異表達基因的KEGG聚類顯示多達104個基因是功能未知或者不參與到功能聚類中的，而在有功能注釋的基因中，大部分與蛋白質和酶類的轉運途徑、代謝途徑密切相關。通過進一步對相同培養(yǎng)條件下hfq基因缺失株和親本菌株的蛋白質組學研究表明在羊種布魯菌16M的hfq基因缺失株中，有55個蛋白的表達水平發(fā)生改變，包括18個表達水平上調的蛋白和37個表達水平下調的蛋白。通過對這些蛋白功能的分析表明有36個蛋白與轉運和代謝相關，這一結果也與基因芯片的結果相吻合[14]。以上研究表明布魯菌的Hfq蛋白的主要功能是影響細菌的轉運和代謝等相關的生物途徑。

作為一個RNA伴侶分子，Hfq的功能主要是通過介導sRNA與其靶點mRNA之間的相互作用來進行轉錄后調控。2012年Caswell C C等[19]發(fā)現(xiàn)在牛種布魯菌2308中發(fā)現(xiàn)Hfq蛋白可以直接結合2個與布魯菌毒力相關的sRNA(AbcR1和AbcR2)，而且當hfq基因缺失后，這兩個sRNA無法表達。此外，Wang Y等[20]在2015年也發(fā)現(xiàn)在羊種布魯菌中有3個sRNA在hfq基因缺失株中轉錄水平顯著減少，這意味著布魯菌Hfq蛋白對于sRNA的轉錄或者穩(wěn)定性發(fā)揮著重要作用。

3 布魯菌Hfq的應用

布魯菌病作為一種全球流行的人獸共患病對于畜牧業(yè)發(fā)展以及人類的公共衛(wèi)生造成嚴重的威脅。對家畜進行疫苗免疫是在布病高發(fā)地區(qū)控制該病流行的一種重要措施[21]。目前在國內外使用的各種活疫苗中存在著毒力偏強、無法免疫懷孕動物、免疫持續(xù)期短、無法鑒別自然感染與疫苗免疫等多種問題。2013年石河子大學的張俊波等發(fā)現(xiàn)使用羊種布魯菌16M的hfq基因缺失株免疫Balb/c小鼠后進行同源攻毒可以產(chǎn)生與現(xiàn)有的M5-90和Rev.1疫苗株類似的保護力。與此同時，由于Hfq蛋白具有良好的免疫原性，可以通過檢測血清中Hfq蛋白的抗體來區(qū)分hfq基因缺失疫苗免疫和野生株感染[22]。

研究表明在大腸埃希菌和沙門菌中約有一半的sRNA與Hfq蛋白密切相關。在大腸埃希菌中已經(jīng)有研究通過將Hfq蛋白的多克隆抗體與大腸埃希菌胞內提取物共同孵育，通過免疫共沉淀成功富集了約1/3已經(jīng)的sRNA[23]。因此，在布魯菌中同樣可以制備Hfq蛋白的抗體通過免疫共沉淀的方法鑒定與Hfq蛋白結合的sRNA。

4 展望

布魯菌的Hfq蛋白對于調控Ⅳ型分泌系統(tǒng)、群體感應系統(tǒng)、耐受應激環(huán)境相關蛋白、sRNA的正常表達，而這些分子與布魯菌的毒力密切相關，因此對布魯菌Hfq蛋白功能的研究對于揭示布魯菌的致病機制以及sRNA介導的轉錄后調控網(wǎng)絡有著重要的意義。此外，由于hfq基因缺失株具有毒力弱、能夠鑒別自然感染與疫苗免疫等方面的優(yōu)勢，其在開發(fā)新型布病疫苗方面具有光明的前景。

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Progress on Hfq Protein in Brucella spp.

DONG Hao1,NIU Hui2,PENG Xiao-wei3,WANG Xiao-ying1,SUN Yu1,SONG Xiao-hui1

(1.ChinaAnimalDiseaseControlCenter，Beijing，102600，China；2.NO.2RadiologyDepartment,QingdaoCancerHospital，Qingdao，Shandong,266042，China；3.CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgricultureUniversity，Beijing，100193，China)

Brucellosis is a serious zoonosis.As the pathogen of brucellosis,Brucellaspp.could resist various bactericidal mechanisms and persist for a long time in the host cells.After invading the host cells,Brucellastrains need to adapt to the harsh intracellular environment by fine-tuning of their gene expression.Hfq protein is a RNA chaperone protein,which plays an important role in the sRNA mediated post-transcription regulation.In many bacteria,various studies have been performed about Hfq protein.At present,this protein has been found to be involved in bacterial gene expression,stress responses,and bacterial virulence.This paper summarized the structure of Hfq protein,its functions of regulating sRNA,and focused on the developments inBrucellaHfq protein.This paper provided valuable materials for studies ofBrucellagene expression and technology of brucellosis prevention and control.

Brucella; Hfq protein; sRNA

2015-06-07

董 浩(1985-)，男，山東威海人，獸醫(yī)師，博士，主要從事人畜共患病防控技術研究。*通訊作者

S852.614

A

1007-5038(2016)01-0093-03