蔡穎，徐玉生，鄭璠，沈玄霖，頓耀山，劉遂心

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 康復(fù)科，湖南 長沙 410008）

心血管疾病已經(jīng)成為全世界所面臨的最嚴(yán)重公眾健康問題,據(jù)2014年《中國心血管病報(bào)告》顯示，心血管疾病是我國居民首要死亡原因。研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可改善心血管病患者的心臟功能，降低心血管疾病患者的再住院率、再發(fā)心血管事件率和死亡率[1]。近年來，已有研究報(bào)道運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)于哺乳動(dòng)物和人類心臟功能的影響，但運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌保護(hù)的確切機(jī)制尚不十分清楚。

熱休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）又稱應(yīng)激蛋白（stress proteins,SPs），是一類在應(yīng)激狀態(tài)下如高溫大量合成的蛋白[2-3]。熱休克蛋白結(jié)構(gòu)保守，功能廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳類動(dòng)物中熱休克蛋白主要有HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、HSP27和αβ-晶狀體蛋白等多種基因型。熱休克蛋白的心肌保護(hù)作用已研究甚多，大量研究證實(shí)熱休克蛋白中HSP27、70、90以及αβ-晶狀體蛋白能夠參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、抗自由基和減少鈣超載等多個(gè)反應(yīng)機(jī)制，從而在高溫和缺血等應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)心肌起保護(hù)作用[3-6]。然而，目前關(guān)于運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)心肌熱休克蛋白表達(dá)影響的研究比較少見。本研究觀察12周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠心臟功能以及心肌熱休克蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)心肌保護(hù)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的健康雄性昆明小鼠16只，體重22～30 g，隨機(jī)平均分為運(yùn)動(dòng)組和對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 運(yùn)動(dòng)組小鼠（8只）運(yùn)用ZH-PT小鼠跑臺(tái)（安徽淮北正華公司）給予平板跑步訓(xùn)練，總干預(yù)時(shí)間為12周，每周運(yùn)動(dòng)5 d，休息2 d。運(yùn)動(dòng)干預(yù)前后兩組小鼠均行心臟超聲檢查以觀察心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化。12周運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，麻醉處死小鼠，取小鼠心臟左室中部心肌行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining,HE染色法）觀察心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，取左室上部心肌采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription PCR,RT-PCR）觀察心肌細(xì)胞心肌熱休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）信使RNA（mRNA）的表達(dá)。

1.2.2 運(yùn)動(dòng)組小鼠干預(yù)措施 正式運(yùn)動(dòng)干預(yù)前給予10 min/d，速度為5 m/min，坡度為0%適應(yīng)性訓(xùn)練5 d。休息2 d后正式開始運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，起始跑速為10 m/min，時(shí)間20 min，跑臺(tái)傾角0°。隔日增加運(yùn)動(dòng)時(shí)間10 min；每周增加跑速1 m/min，跑臺(tái)傾角增加1°，直到跑速增至15 m/min，時(shí)間增至60 min，跑臺(tái)傾角增至6°，維持以上運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度直至運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練結(jié)束。運(yùn)動(dòng)組小鼠每天均在同一時(shí)間予以跑步訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)對(duì)照組小鼠放置跑臺(tái)邊，用以平衡其他干擾因素。對(duì)照組小鼠除不予以平板運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練外，其余實(shí)驗(yàn)步驟同運(yùn)動(dòng)組。

1.2.3 小鼠心臟彩超 腹腔麻醉各組小鼠，采用Vevo 770小動(dòng)物高分辨超聲儀（加拿大Visual Sonics公司）觀察小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能，采用10S探頭（最大頻率11.5 MHz，中心頻率10 MHz）對(duì)小鼠心臟進(jìn)行掃查，圖像深度調(diào)至2.0～4.0 cm。在小鼠左心室長軸切面上測量并記錄左室內(nèi)徑厚度（LV）、室間隔厚度（IVS）、左室后壁厚度（LVPW）、左室重量指數(shù)（左室重量/體表面積，LVMI）和通過M型超聲測算左室射血分?jǐn)?shù)（EF），所有數(shù)據(jù)測量3次后取其平均值并記錄。

1.2.4 標(biāo)本采集及處理 腹腔麻醉處死各組小鼠，在滅酶條件下快速分離小鼠左心室游離壁，取小鼠左心室中部組織置于10%甲醛溶液中，固定24 h后制作石蠟切片，給予HE染色法并在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠心肌組織病理學(xué)改變。取小鼠左心室上部組織置于凍存管，液氮凍存后予RT-PCR檢測小鼠心肌熱休克蛋白的表達(dá)。

1.2.5 檢測心肌熱休克蛋白表達(dá) 采用內(nèi)參比法RT-PCR（德國Eppendorf PCR儀）檢測HSPs mRNA的表達(dá)。取小鼠左心室心肌組織，提取總RNA，測定其含量及純度后進(jìn)行互補(bǔ)DNA（cDNA）合成。取cDNA 4 μl作為模板，依次加入10 μM的上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl、2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl，然后進(jìn)行目的基因聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）?？偡磻?yīng)體系為10 μl，HSP27的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，共30 cycles，72℃延伸10 min，4℃保存；HSP70的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，共30 cycles，72℃延伸10 min，4℃保存；HSP90的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，共30 cycles，72℃延伸10 min，4℃保存；αβ-晶體蛋白的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30 cycles，72℃延伸10 min，4℃保存；GAPDH的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，共22 cycles，72℃延伸10 min，4℃保存；β-actin的反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4 min，95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30 cycles，72℃延伸8 min，4℃保存。最后將PCR產(chǎn)物在60 V恒壓下給予40 min電泳（BioRad公司電泳儀），用TANON GIS2020凝膠分析儀（上海天能科技有限公司）數(shù)碼拍照，Image-pro plus v 6.0圖像分析軟件對(duì)電泳結(jié)果予半定量分析。

表1 引物設(shè)計(jì)表

1.2.6 引物設(shè)計(jì) 在GeneBank中查詢小鼠目的基因mRNA序列后通過Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，見表1。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；用Levene檢驗(yàn)數(shù)據(jù)方差齊性，P＞0.05認(rèn)為方差齊性；兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；Spearman相關(guān)分析兩變量間的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠心臟彩超指標(biāo)情況比較

心臟超聲結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)組小鼠心臟左室內(nèi)徑（LV）較對(duì)照組明顯減小（P＜0.05）；運(yùn)動(dòng)組小鼠心臟室間隔厚度（IVS）、左室后壁厚度（LVPW）較對(duì)照組明顯增加（P＜0.05,P＜0.01）；左室重量指數(shù)（LVMI）、射血分?jǐn)?shù)（EF）較對(duì)照組明顯增加（P＜0.05,P＜0.01），見表2。

表2 TEP組與TAPP組相關(guān)指標(biāo)比較 （±s）

表2 TEP組與TAPP組相關(guān)指標(biāo)比較 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與對(duì)照組比較，P＜0.01。

組別 例數(shù) LV/mm IVS/mm LVPW/mm LVMI/(g/cm2) EF/%對(duì)照組 8 2.17±0.30 0.80±0.09 0.79±0.09 0.52±0.17 81.6±7.26運(yùn)動(dòng)組 8 1.71±0.372） 1.22±0.132） 1.28±0.302） 0.83±0.261） 90.0±3.162）t值 2.73 7.51 4.42 2.82 3.00 P值 0.018 0.030 0.000 0.013 0.009

2.2 兩組小鼠左心室游離壁光鏡檢查

運(yùn)動(dòng)組小鼠心肌與對(duì)照組相比纖維排列整齊、體積明顯增粗、細(xì)胞明顯增大且邊緣變鈍，見圖1、 2。

2.3 RT-PCR法檢測兩個(gè)組小鼠心肌HSPs mRNA的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果示HSP70、90、27和 aβ-晶狀體蛋白陽性信號(hào)分別在300 bp、320 bp、533 bp和610 bp出現(xiàn)，內(nèi)參GADPH在588 bp出現(xiàn)，β-actin在210 bp出現(xiàn)見圖3～6。運(yùn)動(dòng)組小鼠心肌HSP27、70、90和αβ-晶狀體蛋白mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組小鼠，兩組小鼠心肌HSP27、70、90和αβ-晶狀體蛋白mRNA表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

圖1 對(duì)照組心肌

圖2 運(yùn)動(dòng)組心肌

圖3 RT-PCR 法檢測HSP70mRNA

圖4 RT-PCR 法檢測HSP90mRNA

圖6 RT-PCR 法檢測aβ-晶狀體蛋白

表3 兩組小鼠心肌HSPs mRNA表達(dá)的比較 （±s）

表3 兩組小鼠心肌HSPs mRNA表達(dá)的比較 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與對(duì)照組比較，P＜0.01。

組別 例數(shù) HSP70 HSP90 HSP27 αβ-晶體蛋白對(duì)照組 8 0.59±0.24 0.65±0.31 0.98±.054 0.84±0.39運(yùn)動(dòng)組 8 2.36±0.321）2.29±0.471）2.15±1.222）2.16±0.452）t值 12.51 8.23 2.71 6.27 P值 0.030 0.025 0.002 0.001

3 討論

本研究中的小鼠從運(yùn)動(dòng)方式、強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間及頻率等方面模擬人體的有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，采用12 周逐漸遞增的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練[7-8]，直到跑速至15 m/min,跑臺(tái)傾角6°，運(yùn)動(dòng)時(shí)間至60 min,并維持以上運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度至跑臺(tái)訓(xùn)練結(jié)束，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示此運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方法安全有效。

大量基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)長期的中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可引起心臟發(fā)生一系列的適應(yīng)性改變，比如心臟生理性的肥厚，心肌纖維收縮功能增強(qiáng)，最大心搏量的增加以及心臟對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)增加等保護(hù)功能[9]。臨床實(shí)踐中，研究者發(fā)現(xiàn)在注意患者安全和加強(qiáng)監(jiān)護(hù)的前提下,盡量達(dá)到運(yùn)動(dòng)處方的運(yùn)動(dòng)量,運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能改善心血管疾病患者心臟的功能,提高其生活質(zhì)量[10]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過12 周的有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)，運(yùn)動(dòng)組小鼠心臟左室內(nèi)徑明顯減小，心臟室間隔厚度、左室后壁厚度及左室重量指數(shù)明顯增加，說明有氧運(yùn)動(dòng)能引起小鼠心臟生理性的肥厚；左室射血分?jǐn)?shù)明顯增加，說明小鼠心臟泵血功能增強(qiáng)。同時(shí)小鼠心肌標(biāo)本HE染色光鏡顯示運(yùn)動(dòng)組小鼠心肌細(xì)胞排列有序，細(xì)胞體積明顯增大，心肌纖維增粗，進(jìn)一步確認(rèn)有氧運(yùn)動(dòng)能夠引起小鼠心臟生理性肥厚。本研究從心臟形態(tài)學(xué)、病理檢查等多方面論證，長期中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠引起小鼠心臟生理性的肥厚，增強(qiáng)心肌收縮功能，改善心臟供血功能。這些結(jié)果與國內(nèi)外研究成果一致[11-13]，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練確實(shí)能改善心臟功能。運(yùn)動(dòng)組小鼠心肌HSP27、HSP70、HSP90和aβ-晶狀體蛋白mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)，說明有氧運(yùn)動(dòng)能夠引起小鼠心肌熱休克蛋白mRNA的表達(dá)。金怡等[14]的研究發(fā)現(xiàn)低等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠誘導(dǎo)熱休克蛋白表達(dá)的增加，但是高等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)則減少了熱休克蛋白的表達(dá)，不能有效抑制心肌細(xì)胞凋亡，不利于心肌的保護(hù)作用。與之相反的是，胡亞哲等[15]報(bào)道高等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，心肌細(xì)胞HSP70表達(dá)增加的更明顯。他認(rèn)為隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加，機(jī)體內(nèi)環(huán)境更加紊亂，變性蛋白質(zhì)增加的更明顯，進(jìn)而誘導(dǎo)熱休克蛋白mRNA表達(dá)增加的更明顯。中等強(qiáng)度是目前絕大多數(shù)研究采用的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練強(qiáng)度，本研究采用的就是中等強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)。本研究發(fā)現(xiàn)12周中等強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)可以引起小鼠心肌HSP27、HSP70、HSP90和aβ-晶狀體蛋白mRNA表達(dá)的明顯上調(diào)，這與Demirel等[16]的研究結(jié)果一致。Demirel等發(fā)現(xiàn)10～12周中等強(qiáng)度（65%～75% VO2max,60 min/d）的跑臺(tái)訓(xùn)練后，大鼠心肌熱休克蛋白水平較前增加5倍。從本研究結(jié)果來看，長期中等強(qiáng)度有氧訓(xùn)練可以引起熱休克蛋白表達(dá)明顯升高。

熱休克蛋白在正常狀態(tài)下普遍表達(dá),在機(jī)體應(yīng)激的情況下表達(dá)明顯增加。熱休克蛋白的過度表達(dá),能夠保護(hù)心肌缺血時(shí)細(xì)胞微管、肌動(dòng)蛋白骨架和內(nèi)皮細(xì)胞的完整性；能阻礙心肌細(xì)胞凋亡；并能參與蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子的折疊和激活，參與黏附NO合成酶以及刺激其活性,還能下調(diào)其細(xì)胞因子產(chǎn)物。Vander等[17]研究發(fā)現(xiàn),提高犬心肌細(xì)胞HSP27的表達(dá)能夠降低再灌注后對(duì)心臟功能和心肌代謝的敏感性。Jayakumar等[18]研究表明,熱休克蛋白HSP70可以在缺血/再灌注情況下保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。另一方面，Christians等[19]認(rèn)為HSP70可能通過阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放從而抑制細(xì)胞的凋亡。Kupatt等[20]認(rèn)為熱休克蛋白HSP90的過度表達(dá)可以明顯減少心肌缺血/再灌注損傷,而這種作用主要是通過激發(fā)內(nèi)源性-氧化氮途徑實(shí)現(xiàn)的。此外，Liu等[21]發(fā)現(xiàn)αβ-晶狀體蛋白可抑制Bid活化，抑制Cyt C釋放，與CytC、P53和Bax等蛋白相互作用從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果中運(yùn)動(dòng)組小鼠心臟功能增強(qiáng)，心肌細(xì)胞HSP27、HSP70、HSP90和αβ-晶狀體蛋白mRNA表達(dá)上調(diào)，說明有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練增強(qiáng)心肌保護(hù)作用的機(jī)制可能與心肌熱休克蛋白（HSPs）mRNA表達(dá)的上調(diào)有關(guān)。其具體的機(jī)制可能為調(diào)節(jié)蛋白的合成、折疊、運(yùn)輸和降解過程，調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性，保護(hù)線粒體和質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，通過抑制細(xì)胞色素酶C的釋放以及對(duì)Bcl-2的穩(wěn)定作用實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制，減少細(xì)胞凋亡，修復(fù)受損的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞的穩(wěn)定性，參與激活應(yīng)激性核轉(zhuǎn)錄因子，比如HSP90可以激活缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)。在組織缺氧時(shí)，HIF-1α因子可繼續(xù)誘導(dǎo)糖酵解酶A、乳酸脫氫酶A和磷酸果糖激酶-1等糖酵解酶以及血管內(nèi)皮生長因子、HO-1及NOS等分子的基因轉(zhuǎn)錄,增強(qiáng)組織耐缺氧能力[22]。

綜上所述，長期中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)可引起小鼠心肌肥厚，心功能增加。其機(jī)理可能與有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞HSPs表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

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