韓　星

(遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)管理站，遼寧 沈陽(yáng) 110032)

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淺談?dòng)绊懛N公牛凍精生產(chǎn)的若干技術(shù)因素

韓星

(遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)管理站，遼寧 沈陽(yáng) 110032)

摘要：通過(guò)對(duì)凍精生產(chǎn)中，能夠影響精子生命的幾個(gè)環(huán)節(jié)(采精、精夜稀釋、冷凍技術(shù)、解凍方法等)存在的問(wèn)題及影響因素進(jìn)行分析研究，提出了提高精液質(zhì)量的建議。

關(guān)鍵詞：種公牛；凍精；質(zhì)量

隨著應(yīng)用冷凍精液進(jìn)行人工輸精技術(shù)的推廣普及，對(duì)冷凍精液的數(shù)量需求逐漸擴(kuò)大，同時(shí)對(duì)凍精產(chǎn)品質(zhì)量的要求也提高了。然而在凍精生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)精子造成傷害的因素有很多。因此，在制作凍精時(shí)，一定要設(shè)法使破壞精子生命力的因素減少到最低程度以致消除。通過(guò)對(duì)凍精制作中幾個(gè)環(huán)節(jié)的分析，以尋求有利于精子生命的最佳制作條件。

1采精技術(shù)及精液品質(zhì)檢查的影響

1.1采精技術(shù)的影響

采精是凍精生產(chǎn)的第一個(gè)環(huán)節(jié)，采精技術(shù)的好壞直接影響到精液的質(zhì)量。在采精過(guò)程中，技術(shù)是否熟練及假陰道的壓力、溫度、潤(rùn)滑度是否適宜，對(duì)精液是否成功采集十分重要。采精所用的種公牛必須保證體質(zhì)健壯，無(wú)肺疫、結(jié)核病、布氏桿菌病等傳染病。對(duì)于成年種公牛每周采精兩次，每次可根據(jù)具體情況和需要連續(xù)采精兩回。采精過(guò)頻會(huì)導(dǎo)致精液量少，密度低。長(zhǎng)時(shí)間不采，會(huì)導(dǎo)致所采精液中死精過(guò)多，兩者都不利于凍精生產(chǎn)和種公牛生產(chǎn)潛力的發(fā)揮。

為保證所采精液不受污染，采精場(chǎng)地應(yīng)事先打掃干凈，并做好消毒工作。采精前公牛的后軀，特別是尾根肛門(mén)等部位先用溫水徹底清洗干凈，再用干凈抹布擦干。種公牛的陰莖和包皮先用溫水洗凈，然后用滅菌生理鹽水沖洗干凈。此外，采精前種公牛還需要一個(gè)性準(zhǔn)備的過(guò)程。實(shí)踐證明，公牛采精前性準(zhǔn)備充分與否直接影響到采精量、精子的活率和密度。因此在采精前常用一些誘情方法，如是公牛在母牛附近停留片刻進(jìn)行多次空爬跨或讓待采精的公牛觀摩另一頭公牛爬跨等。這些準(zhǔn)備活動(dòng)有助于精液質(zhì)量的提高。

1.2精液品質(zhì)的影響

精液采下后要對(duì)其品質(zhì)進(jìn)行檢查。首先是肉眼觀察，正常精液一般為乳白色或淡黃色。如精液帶綠色，則精液中有膿液或尿液；若帶紅色或紅褐色，可判斷該牛有炎癥。這時(shí)精液應(yīng)該廢棄不能進(jìn)行冷凍。對(duì)于肉眼檢查合格的精液，還要進(jìn)一步通過(guò)顯微檢查，查看精子密度、活率、畸形率、頂體完整率的情況，對(duì)于低于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的精液要廢棄。經(jīng)檢查各項(xiàng)指標(biāo)合格者，才能進(jìn)一步稀釋、冷凍。只有精液原液的質(zhì)量好，才能保證凍精的質(zhì)量。為防止低溫對(duì)凍精的冷打擊，檢查過(guò)程需把精液放在30 ℃的水浴中，以免影響精子的活力。

日光燈對(duì)精子有不良影響，日光照射也如此，因此在進(jìn)行精液檢查時(shí)應(yīng)盡量減少不必要的光照。同時(shí)，還要避免對(duì)精子有害射線的輻射。

2稀釋液的配制及甘油含量的影響

2.1稀釋液保護(hù)劑對(duì)冷凍前精子活力的影響

稀釋液保護(hù)劑的好壞對(duì)冷凍前精子的活力有很大的影響。配制稀釋液所用的藥品試劑必須是分析純的，蒸餾水用重蒸餾的，要求純凈、新鮮。藥品試劑按一定比例混合，溶解過(guò)濾，還要密封消毒處理，以確保對(duì)精子無(wú)害或危害甚微。消毒采用煮沸的方法，煮沸時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以防止炭化變質(zhì)，起不到保護(hù)精子的作用。抑制細(xì)菌的青鏈霉素不是多多益善，一般按每100 mL稀釋液加50～100萬(wàn)單位，用量過(guò)多對(duì)精子有殺害作用。

2.2 血細(xì)胞常規(guī)和骨髓細(xì)胞形態(tài)分析 骨髓中原始細(xì)胞比例，外周血中白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)和血小板(PLT)的量在CD56+和CD56-組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.2甘油對(duì)精子活力的影響

稀釋液既是精液的營(yíng)養(yǎng)成分，又是保護(hù)劑，甘油是其中的冷凍保護(hù)劑之一。甘油的保護(hù)作用是通過(guò)減緩水的結(jié)晶過(guò)程，縮小危險(xiǎn)溫區(qū)的范圍來(lái)實(shí)現(xiàn)的。但并非是加入保護(hù)劑后，危險(xiǎn)溫區(qū)就不存在了，牛精子的危險(xiǎn)溫區(qū)是0～-60 ℃，其中最危險(xiǎn)的溫區(qū)是-15 ℃～-25 ℃。通過(guò)稀釋液中加入甘油后，能沖淡溶液的濃度，也就是說(shuō)甘油代替一部分游離水進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)，使游離水連同無(wú)機(jī)鹽一起被排除，降低細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度，阻止在-15 ℃以下引起精子蛋白質(zhì)變性，在冷凍過(guò)程中起到一定的保護(hù)作用。此外，甘油還容易通過(guò)細(xì)胞膜，解凍時(shí)能保護(hù)精子免受稀釋性傷害，還可使精子中的G07酶免受凍害而溢出。

實(shí)踐證明，甘油在常溫下對(duì)精子有害，可以損傷精子頂體和破壞某些酶。因此，稀釋液中不可沒(méi)有甘油，但又要減少其含量。據(jù)各種資料報(bào)道牛精液稀釋液保護(hù)劑中甘油含量減少到5%～7%效果較好。甘油含量減少到3.3%左右時(shí)效果會(huì)更好。但是目前采用的一次稀釋法無(wú)法控制甘油的最終濃度：比如10%的甘油稀釋液按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的比例稀釋，其最終甘油濃度分別為5.00%、6.60%、7.50%和8.00%?？梢钥闯?，稀釋比例越小最終甘油含量越少。而且經(jīng)測(cè)定，一次稀釋法G07酶漏到精子里，說(shuō)明精子膜已受到傷害。

為了解決這兩個(gè)問(wèn)題，人們?cè)趯?shí)踐中摸索出兩次稀釋的方法：第一次先加入無(wú)甘油的稀釋液，加到所需稀釋總量的一半，第二次(含甘油10%的稀釋液)加到所需總量，這樣一來(lái)，無(wú)論稀釋倍數(shù)多大，甘油濃度都是5%。但要注意，第二次需在降溫后緩慢加入，因?yàn)閯偛傻降幕钴S精子在高滲環(huán)境中受打擊很大。

3稀釋液溫度變化的影響

溫度影響精子的代謝率和活力，精子在體溫(37 ℃～38 ℃)情況下保持正常運(yùn)動(dòng)，如果高于這個(gè)溫度，則活動(dòng)加劇。據(jù)有關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，精子能忍受的最高溫度約為41 ℃。精子在低溫環(huán)境下，代謝活動(dòng)受到抑制。但是，使精液溫度緩慢降至0 ℃，對(duì)精子的存活力沒(méi)有影響，而溫度下降急劇，則會(huì)對(duì)精子的代謝、活動(dòng)力、受精性能造成不可逆的不良影響。這是因?yàn)榫拥募?xì)胞膜受到破壞，從而使三磷酸腺苷、紅細(xì)胞素、蛋白質(zhì)等從細(xì)胞膜破壞處漏出。精子的滲透壓增加，產(chǎn)生不可逆的變化，以致?lián)p害其結(jié)構(gòu)和活動(dòng)力，這就是所謂的低溫打擊。鑒于此，在稀釋精液時(shí)一定要把稀釋液放在30 ℃左右的恒溫箱中，使所采新鮮精液和稀釋液處于同一溫度的水中。特別是在寒冷的冬季，自然狀態(tài)下的稀釋液會(huì)下降到0 ℃左右，而新采的精液卻比體溫略低，這樣30 ℃的鮮精液猛然和0 ℃左右的稀釋液相遇，會(huì)對(duì)精子造成不可逆的損傷，使相當(dāng)一部分精子失去活力。稀釋液必須經(jīng)過(guò)預(yù)熱和新鮮精液處于同一溫度水平下進(jìn)行稀釋。對(duì)于稀釋后的精液，應(yīng)放入低溫操作裝置中，使精液溫度緩慢降至0～5 ℃。

4冷凍技術(shù)因素的影響

精液冷凍是精液處理過(guò)程中相當(dāng)關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)，冷凍技術(shù)的好壞對(duì)凍后精子活率的影響很大。如果此環(huán)節(jié)把握不好，即使前面的工作做的再好，也會(huì)前功盡棄。在精液冷凍技術(shù)中，由冷凍溫度和降溫速度構(gòu)成的冷凍溫度曲線是影響精子冷凍后活率、頂體完整率等的主要因素。冷凍過(guò)程中精子通過(guò)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生致死性傷害的危險(xiǎn)溫區(qū)(0～60 ℃)速度，決定著冷凍后精子活率的高低。

4.1冷凍精液生產(chǎn)中的溫度變化

冷凍精液時(shí)，精液和冷凍環(huán)境之間有著120～180 ℃的溫差，因此二者之間存在著熱交換的過(guò)程，直到溫差為零，即達(dá)到所謂的熱平衡狀態(tài)，維持片刻后精液與冷凍面的溫度變化同步下降，達(dá)到要求的溫度后浸入液氮。精液降溫要求快速通過(guò)0～60 ℃的危險(xiǎn)溫區(qū)，以保證冷凍精液的質(zhì)量。精液降溫的速度與冷凍容器、冷凍環(huán)境的溫度及每批精液冷凍總?cè)萘坑兄苯拥年P(guān)系。北京和洛陽(yáng)種公牛站的測(cè)試結(jié)果表明，隨著每批冷凍精液量的增加，熱平衡溫度升高，降溫速度減慢，通過(guò)危險(xiǎn)區(qū)的時(shí)間延長(zhǎng)。增大冷凍容器的熱容量，減少精液部分的熱容量，特別應(yīng)注意承載精液的鋼架式冷凍板面必須經(jīng)預(yù)冷至始凍溫度，以加速精液的降溫速度，使精液盡快通過(guò)危險(xiǎn)溫區(qū)。

4.2.1細(xì)管型

冷凍前冷凍槽中要倒入適量的液氮，蓋上槽蓋，使之有個(gè)預(yù)冷的過(guò)程。細(xì)管及管內(nèi)精液溫度凍前要求與承載細(xì)管的網(wǎng)架保持一致。往網(wǎng)架內(nèi)裝細(xì)管精液時(shí)在4～5 ℃的低溫箱內(nèi)進(jìn)行操作，同時(shí)筐內(nèi)各網(wǎng)孔要盡量裝滿，以保證冷凍過(guò)程保持一定的降溫曲線。凍制細(xì)管精液并不是直接把金屬網(wǎng)架浸入冷凍槽中進(jìn)行冷凍，這樣會(huì)造成大批精子死亡。冷凍時(shí)，金屬網(wǎng)架在液氮面上停留一會(huì)兒，保證始凍溫度在-8 ℃～-1.2 ℃范圍內(nèi)。北京種公牛站的測(cè)試結(jié)果表明，始冷凍在此范圍內(nèi)冷凍效果較好。目前承載細(xì)管精液用的是冷凍篩板或金屬網(wǎng)架，一次可冷凍細(xì)管數(shù)百支。

4.2.2顆粒型

顆粒精液用鋁板、銅網(wǎng)或聚四氟乙烯板等材料作為冷凍面，精液是陸續(xù)逐粒滴在冷凍面上。因此造成精液顆粒之間始凍溫度存在差異，隨著滴凍精液數(shù)量的增加冷凍面的溫度升高，始凍溫度也不斷升高。如果冷凍面質(zhì)量或?qū)嵝阅懿?，加之外界氣溫環(huán)境的影響，精液降溫速度緩慢，通過(guò)危險(xiǎn)區(qū)的時(shí)間延長(zhǎng)，很容易使精液進(jìn)入危險(xiǎn)溫區(qū)，造成冷凍效果不好。為了保證冷凍精液的效果，目前國(guó)內(nèi)使用聚四氟乙烯板凍制顆粒精液，充分利用它隔熱性能好這一特點(diǎn)，減少顆粒精液之間的始凍溫度差異。同時(shí)，在滴凍前要使精液和接觸精液的器皿如滴管、小試管等，保持同一溫度0～5 ℃。精液在滴凍前要混合均勻，使滴凍出的顆粒精子密度均勻。在滴凍過(guò)程中要迅速滴凍，滴凍結(jié)束后容器需加蓋，以減少在外界氣溫下的暴露時(shí)間，確保冷凍效果。

5解凍溫度與解凍方法的影響

精液解凍相對(duì)冷凍來(lái)說(shuō)方法比較簡(jiǎn)單速度快，但不能說(shuō)解凍不重要。牛精子的危險(xiǎn)區(qū)域是0～-60 ℃，所以要以最快的速度越過(guò)這個(gè)區(qū)域，使精子不至于受到傷害，這是解凍中要解決的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。目前世界各國(guó)所采用的解凍溫度不盡相同，通常采用的溫度有快速(40 ℃)，室溫(15～20 ℃)和冷水(4～5 ℃)緩慢解凍三種。我國(guó)當(dāng)前多采用35～40 ℃水浴快速解凍的方法。還有些試驗(yàn)結(jié)果表明，用75 ℃ 12 s，95 ℃ 7 s，98 ℃5 s瞬間解凍0.5 mL細(xì)管精液或用100～135 ℃ 5 s解凍0.25 mL細(xì)管精液，解凍后活率高，頂體完整率可達(dá)76%，明顯高于35～40 ℃下解凍的精液，而75 ℃與90 ℃相比較無(wú)差異。盡管解凍溫度越高，解凍速度越快，越過(guò)危險(xiǎn)區(qū)的時(shí)間就越短，但是生產(chǎn)實(shí)踐中還有一個(gè)經(jīng)驗(yàn)的問(wèn)題，精子處于高溫下時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易使精子在短時(shí)間內(nèi)的能量耗盡，而時(shí)間短了達(dá)不到解凍的目的。因此高溫快速解凍多數(shù)只是在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，在生產(chǎn)上還未得到普遍采用。

對(duì)于顆粒凍精的解凍，由于精液在冷凍前稀釋倍數(shù)較低，解凍時(shí)需加解凍液，解凍液一般用0.9%的檸檬酸鈉液，把1～1.5 mL的檸檬酸鈉液滴入小試管中，然后把小試管放在40 ℃的溫水中預(yù)熱，將顆粒凍精從液氮中取出立即投入小試管中輕搖，待融化到2/3時(shí)，從溫水中取出，繼續(xù)搖動(dòng)使其全部融化。

精液解凍后使用時(shí)間，細(xì)管為1 h(上限)，顆粒為2 h(上限)。如解凍后需外運(yùn)時(shí)，可采取低溫10～15 ℃解凍，然后用脫脂棉或多層紗布包裹，再用塑料袋包好，置4～5 ℃的環(huán)境中儲(chǔ)存，其使用時(shí)間可達(dá)8 h。

實(shí)踐證明，冷凍精液在室溫中停留過(guò)久(超過(guò)10 s)精子的活力會(huì)降低。因此，在解凍前后取放精液時(shí)，動(dòng)作盡量迅速、減少在空氣中停留的時(shí)間，若停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)中途要放回液氮中冷卻一會(huì)兒再接著操作。

6討論

在實(shí)踐中掌握和運(yùn)用熟練的采精技術(shù)，了解個(gè)體采精特點(diǎn)，正確掌握種公牛的采精頻率，同時(shí)做好夏季防熱避暑工作，為種公牛創(chuàng)造比較舒適的環(huán)境，是充分發(fā)揮其生產(chǎn)潛力，使其提供數(shù)量多、質(zhì)量好凍精產(chǎn)品的重要措施。

稀釋精液不能沒(méi)有甘油，但又要越少越好，目前一般為5%～7%。但有資料證明3.3%的甘油含量效果最佳。在降低稀釋液中甘油濃度的情況下，提高凍精質(zhì)量而又不至于使程序復(fù)雜化，還有待于進(jìn)一步研究。

當(dāng)初凍溫度為-110 ℃～-120 ℃，冷凍細(xì)管距液氫面高度4 cm，冷凍數(shù)量200～250支細(xì)管精液時(shí)，凍后活力可達(dá)0.45，經(jīng)生產(chǎn)推廣應(yīng)用效果頗佳。但也存在一些問(wèn)題，操作存在一定的誤差，特別是初凍溫度不易控制一致。要想解決這些問(wèn)題，需要生產(chǎn)出更先進(jìn)的冷凍設(shè)備。

制作凍精是工作的關(guān)鍵，但沒(méi)有優(yōu)質(zhì)的解凍液和正確的解凍方法，效果同樣不理想。試驗(yàn)中溫度越高，解凍速度越快，但是這個(gè)溫度很難把握，就會(huì)使還未進(jìn)入子宮的精子能量消耗殆盡。所以實(shí)際生產(chǎn)中，解凍溫度控制在40±2 ℃為宜。用維生素B12作顆粒凍精解凍液，解凍后精子活力提高，活力下降速度緩慢，人工授精受胎率明顯提高，可進(jìn)一步推廣應(yīng)用于生產(chǎn)中。

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作者簡(jiǎn)介：韓星(1971-)，男，大專，助理畜牧師。

收稿日期：2016-01-11

中圖分類號(hào)：S823.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1005-2739(2016)02-0061-04