趙澤慧，李 強(qiáng)，何小麗，李凡飛，許立華

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，寧夏銀川 750021)

傷寒沙門菌LeuO調(diào)節(jié)蛋白研究進(jìn)展

趙澤慧，李 強(qiáng)，何小麗，李凡飛，許立華*

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，寧夏銀川 750021)

LeuO是傷寒沙門菌復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，其調(diào)控傷寒沙門菌許多參與生物過程的基因表達(dá)，尤其是可以調(diào)控幫助菌體在嚴(yán)苛環(huán)境下生存的基因。作為H-NS的備份LeuO根據(jù)不同的濃度作為活化劑和抑制劑差異性調(diào)節(jié)基因表達(dá)。LeuO還可誘導(dǎo)孔蛋白的表達(dá)，孔蛋白是一種良好的免疫原，當(dāng)作為疫苗接種動(dòng)物，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性免疫力。論文重點(diǎn)圍繞LeuO作為調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)機(jī)制和在免疫學(xué)以及其他相關(guān)最新研究成果進(jìn)行綜述，以期為該類研究的開展提供參考。

LeuO；傷寒沙門菌；H-NS；孔蛋白

沙門菌(Salmonella)是革蘭陰性致病菌，一旦感染可以引起人和動(dòng)物很高的發(fā)病率和病死率[1]。沙門菌通過污染食物和水感染人和動(dòng)物。大部分的沙門菌血清型經(jīng)過小腸感染，最終導(dǎo)致宿主自限性胃腸炎；少部分沙門菌血清型可以引起宿主全身感染，如傷寒沙門菌，鼠傷寒沙門菌等。由于沙門菌感染宿主范圍廣泛，對生存條件要求低，且具有多重耐藥性，導(dǎo)致預(yù)防沙門菌病非常困難[2]。

革蘭陰性菌中大多數(shù)細(xì)菌外膜蛋白(outer membrane protein，Omp)均具有抗原特異性。與其他革蘭陰性菌一樣，沙門菌Omp能刺激易感的宿主產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，因而可用于高效價(jià)抗體和疫苗的研究開發(fā)[3]。在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，OmpC和OmpF膜孔蛋白可以引起機(jī)體產(chǎn)生長時(shí)間抗體反應(yīng)，產(chǎn)生的特異性免疫力可以保護(hù)宿主免受傷寒沙門菌的侵染[4]。除此之外，沙門菌Omp還可以幫助其抵御惡劣的外界環(huán)境，嵌入的蛋白質(zhì)對細(xì)菌細(xì)胞也具有至關(guān)重要的作用，如溶質(zhì)、蛋白質(zhì)參與運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

LeuO全局調(diào)控涉及細(xì)胞多種多樣的功能如細(xì)菌毒力和菌體的生存。LeuO調(diào)節(jié)基因表達(dá)在沙門菌免疫應(yīng)答的方面尤其重要，如上所述的菌體外膜孔蛋白。對LeuO的研究不但有助于了解傷寒沙門菌與外界的相互關(guān)系尤其是在極端條件下依然生存的機(jī)理，而且在免疫學(xué)上為開啟研發(fā)傷寒沙門菌疫苗和作為其他疫苗佐劑成為可能性。本文綜述了探究Leuo調(diào)節(jié)蛋白的過程，調(diào)控機(jī)制，表達(dá)條件以及生物學(xué)功能等方面的研究進(jìn)展，并展望了其在生物技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用前景。

1 LeuO調(diào)節(jié)蛋白

LeuO是原核生物最大轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器(LysR-type transcriptional regulators，LTTRs)的成員。LTTRs通過調(diào)控菌體基因的表達(dá)影響菌體細(xì)胞功能，如氨基酸的生物合成、芳香族化合物的分解代謝、抗生素耐藥性、氧化應(yīng)激應(yīng)答、固氮作用、細(xì)菌群體感應(yīng)以及毒力因子的產(chǎn)生。LTTRs在經(jīng)典模式中不但可以活化不同基因的轉(zhuǎn)錄而且抑制自身的轉(zhuǎn)錄。一些LTTRs成員調(diào)節(jié)自身的表達(dá)，還有一些LTTRs的成員調(diào)節(jié)(激活或抑制)不止一個(gè)靶基因。研究普遍認(rèn)為LTTRs的成員是雙重調(diào)節(jié)子。而LeuO可以作為解除抑制劑，研究表明其具有復(fù)雜的與DNA結(jié)合的位點(diǎn)[5]。LeuO的低聚物結(jié)構(gòu)是一個(gè)四聚體，保證可以與DNA具有高親和力[6]。

研究LeuO的歷史過程曲折而復(fù)雜。有關(guān)LeuO調(diào)節(jié)蛋白首次報(bào)告指出，leuO基因的位置在leuABCD和ilvIH操縱子之間。由于LeuO的氨基酸序列與LysR家族的成員相似，所以當(dāng)時(shí)將其歸為該家族成員。根據(jù)leuO基因的定位，研究者推測leuABCD為其操縱子，盡管leuABCD基因缺失株并沒有出現(xiàn)LeuO的缺失表現(xiàn)。該報(bào)告還闡明LeuO具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用。

LeuO調(diào)節(jié)蛋白參與細(xì)菌惡劣環(huán)境條件下與生存相關(guān)一些重要基因轉(zhuǎn)錄。在H-NS缺失菌株中尋找替代基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，在大腸埃希菌中LeuO過表達(dá)可以抑制cadC基因的轉(zhuǎn)錄。這個(gè)發(fā)現(xiàn)使LeuO和H-NS產(chǎn)生聯(lián)系提供了新觀點(diǎn)。H-NS 是一種小組蛋白相似蛋白，廣泛存在于革蘭陰性菌中。H-NS 不僅參與基因組裝配，而且在基因調(diào)控中也起關(guān)鍵作用。CadC可以激活cadAB操縱子，這是在酸性條件下菌體表達(dá)的重要機(jī)制。在研究霍亂弧菌耐酸反應(yīng)LeuO的作用表明，LeuO是cadC的抑制劑，LeuO的過表達(dá)導(dǎo)致了該菌對于有機(jī)酸敏感度增加[7]。LeuO還可以通過抑制小調(diào)節(jié)子Dsr-RNA(在低溫的條件下正調(diào)控rpoS轉(zhuǎn)錄)來減少rpoS基因的轉(zhuǎn)錄。而H-NS對cadC和dsrA基因的轉(zhuǎn)錄都是抑制作用。有趣的是LeuO對cadAB 操作子以及Rpos基因的轉(zhuǎn)錄的抑制都是間接作用。

基于LeuO是雙重調(diào)節(jié)子的研究，在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)LeuO可以正調(diào)節(jié)bgl和yjjQ-bglj操縱子。而H-NS可以抑制這些基因的表達(dá)。說明LeuO具有抵消H-NS效應(yīng)的作用[8]。bgl操縱子參與一些β-糖苷的利用，而yjjQ-bglj基因編碼的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子是LuxR家族成員。 LuxR 家族調(diào)控蛋白是一類在革蘭陰性細(xì)菌群體感應(yīng)中起重要作用的調(diào)控蛋白，它們參與由?；呓z氨酸內(nèi)酯介導(dǎo)的多種生物學(xué)過程， 如調(diào)控細(xì)菌生物發(fā)光、 質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、 生物膜形成以及多種胞外酶、 毒力因子和次生代謝產(chǎn)物的合成[9]。

隨后一些關(guān)于鼠傷寒沙門菌的研究中描述了一個(gè)叫順式作用啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)機(jī)制模型，其中描述LeuO可以與DNA超螺旋的位點(diǎn)相互作用。在這個(gè)復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制里，亮氨酸-應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(Lrp)通過ilvIH啟動(dòng)子活化從而引起局部DNA超螺旋的改變，暴露了leuO調(diào)節(jié)區(qū)域。而以上過程的順利進(jìn)行都需要leuO的表達(dá)。而且，H-NS的結(jié)合位點(diǎn)在leuO調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)部[10]。

2 沙門菌的調(diào)節(jié)蛋白LeuO

傷寒沙門菌LeuO的過表達(dá)引起了沉默編碼OmpS1和OmpS2孔蛋白基因的表達(dá)。在大腸埃希菌的研究中表明Leuo調(diào)節(jié)蛋白扮演著抑制沉默的作用[11]。而且LeuO的濃度差異會影響OmpS1和OmpS2孔蛋白的表達(dá)量。當(dāng)LeuO濃度低的時(shí)候，ompS2基因表達(dá)；反之，ompS1基因表達(dá)時(shí)，ompS2表達(dá)被抑制。此外，在研究ompS1基因表達(dá)過程中發(fā)現(xiàn)LeuO具有拮抗H-NS的作用[12]。而到目前為止這種功能尚未在LTTRs其他成員中發(fā)現(xiàn)。但別的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子成員，如VirF(AraC/XilS)、RovA(SlyA/Hor)和Ler(H-NS/StpA)在參與調(diào)節(jié)毒力基因表達(dá)時(shí)可作為H-NS的拮抗劑。

隨后在研究傷寒沙門菌過程中發(fā)現(xiàn)，LeuO正調(diào)控assT基因而負(fù)調(diào)控ompX、tpx等基因。這些基因參與多種多樣的細(xì)胞功能。AssT普遍認(rèn)為是芳基硫酸鹽磺基轉(zhuǎn)移酶，可以將有毒的酚衍生物轉(zhuǎn)化為無毒的化合物，參與解毒過程[13]。OmpX是外膜蛋白(Omp), 缺乏OmpX時(shí)提高菌體對于十二烷基磺酸鈉和抗生素的耐受性，因而表現(xiàn)影響疏水性化合物的運(yùn)輸[14]。沙門菌具有較強(qiáng)的生物被膜形成能力，在動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境和肉食品中更易存活，是隱性感染和反復(fù)感染的重要原因之一。LeuO負(fù)調(diào)控Tpx的表達(dá)量就是為了菌體在不同pH環(huán)境都可以生存[15]。

在研究鼠傷寒沙門菌基因組時(shí)，通過使用ChIP-chip,LeuO調(diào)節(jié)子成員范圍擴(kuò)展到SPI-1和SPI-2上的基因。LeuO調(diào)節(jié)子由LeuO調(diào)節(jié)蛋白的編碼基因leuO及其調(diào)控的基因和操縱子所構(gòu)成。LeuO特異性結(jié)合和對基因的調(diào)節(jié)主要依靠LeuO的濃度的改變 。另外一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是LeuO與內(nèi)含子的結(jié)合，因此LeuO很可能作為負(fù)調(diào)控蛋白抑制基因的轉(zhuǎn)錄或作為類核結(jié)構(gòu)的蛋白。LeuO與H-NS和RNA聚合酶多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合的發(fā)現(xiàn)確認(rèn)了LeuO具有拮抗劑作用[5]。

3 LeuO的表達(dá)條件

菌體在一般情況下由于H-NS的存在，leuO基因處于靜默狀態(tài)。在惡劣的環(huán)境特別是在營養(yǎng)物質(zhì)短缺的情況下，研究者才在大腸埃希菌和鼠傷沙門菌中檢測到了leuO基因的表達(dá)。另外，在磷酸鹽限制的培養(yǎng)基中也檢測到了LeuO的存在。leuO基因的表達(dá)不受rpoS調(diào)控，即使它的表達(dá)需要ppGpp(GDP 或 GTP 的衍生物四磷酸或五磷酸鳥嘌呤核苷)的存在[16]。LeuO對于恢復(fù)細(xì)胞生長很重要，當(dāng)缺乏異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸時(shí)，細(xì)胞生長將延后2 h[17]。研究表明，leuO基因可以被RcsB和BglJ調(diào)節(jié)子激活[18]。在研究霍亂弧菌時(shí)發(fā)現(xiàn)ToxR可以激活leuO基因表達(dá)幫助菌體對抗膽汁侵蝕[19]。

4 LeuO的生物學(xué)功能

4.1 免疫學(xué)功能

LeuO在實(shí)驗(yàn)室條件下表達(dá)量很少，在體內(nèi)可能主要參與細(xì)菌的生存。在小鼠感染模型中，傷寒沙門菌LeuO突變體表現(xiàn)毒力下降。而在霍亂孤菌的研究中，LeuO的缺失導(dǎo)致了生物膜形成的減少。

在小鼠模型中，ompC和ompF的雙突變菌株表現(xiàn)毒力下降。OmpC和OmpF孔蛋白介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)的抗體，提供對于傷寒沙門菌病的免疫保護(hù)。這兩個(gè)孔蛋白在實(shí)驗(yàn)室條件下都可以高水平表達(dá)。同樣的情況發(fā)生在缺乏ompS1和ompS2時(shí)，菌株也表現(xiàn)毒力下降。這表明沒有LeuO的調(diào)節(jié)或缺乏OmpS1、mpS2蛋白都會影響細(xì)菌生存。leuO基因、ompS1、ompS2沉默基因的缺失引發(fā)的菌體毒力下降，表明這些基因可以在體內(nèi)條件下表達(dá)。盡管這些孔蛋白在沙門菌的毒力方面發(fā)揮的作用還不是很清楚，但目前的研究都表明這些孔蛋白是溶質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)以及毒素通過細(xì)菌外膜的通道。細(xì)菌正是因?yàn)橛辛诉@些孔蛋白得以在不同的環(huán)境下尤其是在有藥物存在的條件下依然可以生存、繁殖。

研究表明，OmpS1和OmpS2孔蛋白介導(dǎo)小鼠很強(qiáng)的免疫應(yīng)答，且小劑量的孔蛋白就可為對抗傷寒沙門菌的感染提供顯著的保護(hù)。這兩種保護(hù)性抗原在菌體的感染機(jī)體過程中表達(dá)。這些研究具有相關(guān)性，它們?yōu)槭褂眠@兩種蛋白作為抗原開發(fā)針對傷寒和其他非傷寒沙門菌的疫苗成為可能性[20]。

4.2 作為H-NS的備選

研究表明，鼠傷寒沙門菌中活化的leuO抑制了SPI-1的轉(zhuǎn)錄翻譯，從而抑制了菌體侵襲上皮細(xì)胞[21]。Espinosa E等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在有金霉素的環(huán)境下表達(dá)的LeuO通過HilE抑制SPI-1上基因的表達(dá)以及抑制沙門菌入侵上皮細(xì)胞。HilE是由非SPI-1編碼的調(diào)節(jié)子，可以抑制hilD的表達(dá)。而HilD是由SPI-1編碼的正調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)SPI-1上其他基因的表達(dá)。通過體內(nèi)使用β半乳糖苷酶融合分析表明LeuO激活了hilE的表達(dá)[22]。而通過體外狹線印跡法電泳遷移率以及DNase足跡法分析證實(shí)LeuO可以和hilE的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合[22]。LeuO抑制SPI-1基因表達(dá)可能發(fā)生在菌體生長過程中而這時(shí)H-NS卻不知什么原因不能執(zhí)行這樣的功能。

LeuO作為菌體替代H-NS的備用選擇可能有兩個(gè)意義：一是LeuO可以讓沙門菌依然在不良的環(huán)境下生存。而這樣的條件下SPI-1上基因的表達(dá)在細(xì)菌生長階段，細(xì)菌顯然需要付出更高的成本代價(jià)；二是LeuO確保SPI-1基因在菌體侵染腸道時(shí)可以按特定順序恰當(dāng)表達(dá)[21-23]。正因?yàn)槿绱?LeuO可以作為沙門菌H-NS的備用調(diào)節(jié)子，突出了LeuO作用模式的細(xì)微和差異。LeuO的功能就是根據(jù)不同的濃度作為活化劑和抑制劑差異性調(diào)節(jié)基因表達(dá)。

5 展望

通過對LeuO調(diào)控蛋白的研究，在治療以及預(yù)防傷寒沙門菌病等方面將具有重要意義。LeuO調(diào)控機(jī)制的深入研究 ,促進(jìn)人們進(jìn)一步了解相關(guān)抗生素對沙門菌的作用途徑和機(jī)制, 為沙門菌類疾病的治療研究提供分子生物學(xué)方面的理論依據(jù)。當(dāng)然需要在極端環(huán)境或在leuO過表達(dá)的條件下探究其功能，直到現(xiàn)在仍沒有發(fā)現(xiàn)與LeuO相同的誘導(dǎo)物，這些都是未來需要研究的課題。

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Advance in LeuO Transcriptional Regulator ofSalmonellatyphi

ZHAO Ze-hui，LI Qiang，HE Xiao-li，LI Fan-fei ，XU Li-hua

(SchoolofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia, 750021,China)

LeuO,as a transcriptional global regulator,is part of a complex regulatory network. It regulates the expression of genes involved in multiple biological processes，and specifically contributes to regulate expression of genes that help bacteria to survive stress conditions. LeuO could act as a backup regulator for H-NS，and as an activator or as a repressor depends on its concentration to regulate differential gene.It also can induce the expression of porins that have been shown to be immunogens and can be considered as antigenic candidates for vaccines.The porins can induce the host immune response and provide protective immunity toSalmonellainfection. Based on the recent research, the focus on the LeuO a transcriptional regulator in regulatory mechanism and immunology was summarized to provide new ideas for conducting such research in this review.

LeuO；Salmonellatyphi；H-NS ;porins

2016-05-27

寧夏“優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛遺傳改良與選育”專項(xiàng)(2013NYYZ0501)

趙澤慧(1990-),女,山西晉中人,碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。 *通訊作者

S852.612

A

1007-5038(2016)12-0086-04