王雪峰 綜述,蔡愛玲,周明莉 審校

(湖北省血吸蟲病診療中心,湖北荊州 434000)

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血吸蟲病實驗診斷的研究現(xiàn)狀

王雪峰 綜述,蔡愛玲,周明莉△審校

(湖北省血吸蟲病診療中心,湖北荊州 434000)

關鍵詞:血吸蟲??；病原學檢測；免疫學檢測；核酸檢測

血吸蟲病是一種人畜共患寄生蟲病。血吸蟲感染引起的肝臟纖維化，最終可導致患者繼發(fā)門脈高壓征等嚴重后果，使患者喪失勞動能力、生活自理能力、甚至死亡[1-3]。據(jù)報道，全球76個國家和地區(qū)有血吸蟲病流行，受到不同程度感染的人群達2億[4]。血吸蟲病的控制和消滅是一項長期而艱巨的任務，需進一步加大傳染源控制力度[5-6]，提高診斷能力。目前血吸蟲病實驗診斷可分三大類，分別為病原學診斷、免疫學診斷和核酸診斷。本文就近幾十年來發(fā)展的血吸蟲實驗室診斷的研究現(xiàn)狀介紹如下。

1病原學檢測

1.1糞便檢查從糞便中查見蟲卵或孵出毛蚴，是確診的依據(jù)。

1.1.1直接涂片法直接涂片后在顯微鏡下檢查有無血吸蟲蟲卵。其檢出率低，在急性血吸蟲患者的黏液血便內(nèi)較易查到蟲卵。

1.1.2加藤厚涂片法和改良加藤厚涂片法其檢出率高于直接涂片法，可計算每克糞便中的蟲卵數(shù)。在人群感染率5%以上的地區(qū)，可用作常規(guī)查病方法和考核防治效果。

1.1.3自然沉淀法利用血吸蟲卵比重較大、易于沉淀的特點，將糞便沉淀一定時間后，將沉渣在顯微鏡下涂片鏡檢觀察有無血吸蟲蟲卵。此法檢出率高于直接涂片法。

1.1.4尼龍袋集卵法將糞便調(diào)漿后置于上方的40～60目尼龍絹袋和下方的260目尼龍絹袋中，淋水沖洗袋內(nèi)糞渣，使血吸蟲蟲卵集中在下方尼龍絹袋中，在顯微鏡下鏡檢觀察沉渣中有無血吸蟲蟲卵。其檢出率與自然沉淀法相近或稍高。操作簡單，可縮短集卵時間，便于現(xiàn)場查病及大規(guī)模檢查。

1.1.5毛蚴孵化法常用三角燒瓶孵化法。由于成熟日本血吸蟲卵內(nèi)的毛蚴在適宜溫度、光線下，在孵化水中可以很快孵出，并在水中游動，根據(jù)毛蚴的水中運動特征觀察結果。但應區(qū)分孵化水中的原生動物、其他微生物或離子，導致假性實驗結果或干擾結果判定[7]，從而得出假陽性結果。用自然沉淀法、尼龍袋集卵法收集的沉渣作孵化實驗可提高檢出率。在血吸蟲低感染度地區(qū)，主要采用毛蚴孵化法。目前，普遍結合使用，稱為沉淀孵化法和尼龍袋集卵孵化法，其檢出率明顯高于糞便查血吸蟲卵的各種方法。2011年起，在《全國血吸蟲病監(jiān)測方案》中，首次將尼龍絹集卵孵化法作為全國監(jiān)測點病原學檢查的標準方法之一[8]。

1.2腸黏膜活組織檢查通過直腸鏡或乙狀結腸鏡夾取可疑含蟲卵結節(jié)的黏膜組織，壓片鏡檢。根據(jù)形態(tài)或組織化學染色法鑒別蟲卵死活。腸黏膜組織內(nèi)查見活卵、近期變性卵可作為治療的依據(jù)。但腸黏膜活組織檢查有創(chuàng)傷性，具有一定的危險，無療效考核價值。

2免疫學檢測

2.1間接紅細胞凝集試驗(IHA)將血吸蟲可溶性蟲卵抗原吸附于綿羊紅細胞或人O型紅細胞表面，使其成為致敏紅細胞，致敏紅細胞與患者血清中抗體相遇時，在適宜條件下，紅細胞表面吸附的抗原和特異性抗體相結合，形成肉眼可見的紅細胞凝集現(xiàn)象。

2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)血清內(nèi)含特異性抗體或抗原與載體上抗原或抗體特異性結合的試驗方法，其敏感性高、特異性強，陽性符合率為97.6%左右，假陽性率約為2.6%，是現(xiàn)今檢查血吸蟲病的主要免疫診斷方法。由于血吸蟲循環(huán)抗原沒有種屬特異性，因此這些方法不能區(qū)分感染的蟲種[9]。

2.3膠體染料試紙條法試驗(DDIA)利用膠體染料標記蟲卵抗原(SEA)，通過層析法進行檢測。具有高度敏感性，與其他寄生蟲病的交叉反應率很低。該法適合于大規(guī)模的血吸蟲患者群的篩選，操作方便易行。

2.4環(huán)卵沉淀試驗(COPT)COPT為血吸蟲病檢測的特有方法，此法的缺點為反應時間較長，需在48～72 h后才能觀察結果。在低度流行區(qū)的曼氏血吸蟲病檢測中，COPT被認為是診斷血吸蟲病的“金標準”[10]。

2.5斑點金免疫滲濾試驗該檢測方法以硝酸纖維膜為載體，紅色膠體金為標記物，定性檢測人血清中的血吸蟲蟲卵抗體。其方法具有較高的敏感性，操作簡便快捷，整個試驗不需要特殊的儀器設備，適用于大規(guī)模的流行病學調(diào)查,又能作為個別病例單份檢測的免疫學診斷工具[11-12]。

2.6皮內(nèi)試驗皮內(nèi)試驗屬Ⅰ型或Ⅳ型變態(tài)反應，當受試者皮內(nèi)注射少量血吸蟲抗原后，如受試者感染血吸蟲，抗原抗體發(fā)生特異性結合，血管活性物質(zhì)釋放，局部組織呈現(xiàn)紅腫反應，即該試驗為陽性。該法具有早期診斷價值，但無療效考核價值，適用于流行病學調(diào)查的現(xiàn)場篩選。

2.7間接熒光抗體試驗(IFA) 先制作成切片抗原，將血吸蟲病鼠的肝組織切片后附在載玻片上，-20 ℃條件下保存，試驗前先將抗原片在室溫下復溫至少30 min，將熒光素與抗免疫球蛋白抗體結合，制備成熒光素標記的第二抗體。利用抗原抗體特異性結合的特點，在熒光顯微鏡下觀察試驗結果。該方法特異性好且敏感性高。

3核酸檢測

3.1普通聚合酶鏈反應(PCR)使用PCR技術直接探查針對病原體來源的核酸片段，可確定有無病原體感染，該法特異、敏感、快速、簡便、重復性好，易自動化，是一種較理想的基因診斷技術。

3.2降落PCR降落PCR是一種改良PCR，包括變性和退火兩個步驟，Suzuki等[13]報道：應用降落PCR進行擴增，與其他感染人的血吸蟲無交叉反應。在小鼠感染模型中，6周ELISA才能在血清中檢測到抗成蟲及抗蟲卵IgG抗體，感染8周后糞便中才能查到蟲卵，而降落PCR于感染2周后血清中就可以檢測到，具有很好的早期診斷價值，同時由于該方法直接用血清標本作為模板進行PCR擴增，無需血清標本DNA的抽取，使其更具有實用價值。

3.3多重PCR多重PCR又稱多重引物PCR或復合PCR，是在同一反應體系里加入兩對或多對引物，同時擴增出多個針對病原體的核酸片段，具有高效、高產(chǎn)率、能降低實驗成本、加速實驗進程等優(yōu)點[14]。Gobert等[15]曾報道：該方法與病原學檢測方法高度相關，敏感性和特異性可分別達到87.7%和100%。

3.4巢式PCR巢式PCR試驗中有兩對引物，對第一對外引物進行第一輪擴增，其擴增片段與普通相似，將第二對內(nèi)引物結合在第一輪擴增的PCR產(chǎn)物內(nèi)部，這樣第二輪PCR擴增片段短于第一輪擴增產(chǎn)物。由于使用了兩對引物進行了兩輪PCR擴增，這樣增加了檢測的敏感性和可靠性[16]。劉愛平等[17]報道：該方法具有極高的敏感性，在僅存在3～5 對成蟲感染的家兔血清中就能擴增到特異性目的條帶，感染后3 d就可檢測到?？捎糜谌毡狙x低感染度宿主血清的檢測，具有潛在的應用前景。

3.5實時熒光定量PCR該法能對起始模板定量及定性分析，是PCR技術基礎上發(fā)展起來的高度靈敏的核酸定量檢測技術，因其實時、準確、定量、高度重復性、無需進行凝膠電泳的特點，在疾病檢測方面頗受關注[18]，至今在其他領域行業(yè)中得到廣泛應用。

3.6PCR-ELISAPCR-ELISA是一種在PCR擴增后借用ELISA的原理，使用酶標抗體，通過固相或液相雜交來實現(xiàn)定量檢測的一種技術，具有PCR技術的高敏感性、核酸探針的特異性、酶標儀直接讀取結果的客觀性等優(yōu)點，在生物醫(yī)學領域方面得到了廣泛的應用。該技術主要包括3個部分：PCR、擴增產(chǎn)物與探針的雜交、常規(guī)的ELISA酶標顯色。Comes等[19]報道：最小檢測限可達1.3 pg的基因組DNA，且與其他種屬的血吸蟲基因組不發(fā)生交叉反應，其檢測的敏感性和特異性分別可達97.4%和85.1%。

3.7環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)LAMP是一種新穎的恒溫核酸擴增方法，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳等過程，利用一種鏈置換DNA聚合酶，在等溫(60～65 ℃)條件下進行核酸擴增，1 h左右完成，可直接肉眼判讀結果。LAMP具有簡單快速、檢測成本低、靈敏度高、特異性強的特點，且與曼氏血吸蟲、肝吸蟲無種屬交叉反應。該技術不依賴任何專門的儀器設備，不同于其他核酸檢測方法，可以實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測?，F(xiàn)已被應用于非洲錐蟲病、惡性瘧原蟲、甲型肝炎和一些魚類寄生蟲或病毒的診斷，從而為LAMP在日本血吸蟲病的診斷和療效考核中的應用提供了一種新的有效方法[20-22]。

43種實驗室檢測方法的比較

4.1病原學檢測方法病原學檢測方法敏感性低、漏檢率高，但為血吸蟲病診斷的金標準，是確診血吸蟲病的重要依據(jù)。糞便直接涂片法操作簡單，但蟲卵檢出率低；毛蚴孵化法可提高急性血吸蟲病感染的檢出率；直腸鏡活組織檢查主要針對慢性特別是晚期血吸蟲病感染者，有助于發(fā)現(xiàn)沉積于腸黏膜內(nèi)的蟲卵。

4.2免疫學檢測方法

4.2.1抗體檢測如COPT、IHA、ELISA、膠體金試紙條法(DDIA)等，雖具有較高的敏感性和特異性，但不能區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染，因此抗體檢測用于血吸蟲感染的臨床診斷和療效考核并不理想[23]，不能作為血吸蟲病確診依據(jù)，常出現(xiàn)過度化療的狀況,但可用于大規(guī)模的流行病學調(diào)查、防治效果評價和消除驗證。

4.2.2抗原檢測從理論上講可以作為確定現(xiàn)癥感染的理想方法，但是從已發(fā)展的應用單克隆抗體檢測血吸蟲循環(huán)抗原的諸多方法的應用效果來看，并不理想，對慢性患者的檢出率低、特異性差，無法滿足血吸蟲病診斷的需求。

4.3核酸檢測方法近年發(fā)展了多種核酸檢測方法，如核酸分子雜交技術、PCR技術、基因芯片技術等，均具有很好的敏感性和特異性，顯示了廣泛的應用前景，但因靶序列的選擇、實驗場所和專業(yè)儀器設備的限制暫未得到現(xiàn)場大規(guī)模普及應用。血吸蟲的成蟲寄生在宿主腸系膜靜脈中，其不斷排出的蟲卵沉積在肝臟門靜脈系統(tǒng)及腸系膜靜脈中，死亡的成蟲或蟲卵的崩解產(chǎn)物及蟲體生長發(fā)育過程中表膜脫落物將不斷釋放其核酸片段，可出現(xiàn)在宿主的糞便、血液、尿液及其他一些標本中。因此，通過檢測這些核酸片段即可診斷血吸蟲的感染。迄今為止，國內(nèi)外研究人員已進行了很多的研究。

臨床上因為血吸蟲病的癥狀不典型，缺乏特異性的檢測手段，如特異性血清學檢查和影像學檢查，早期糞便蟲卵檢測亦可為陰性，故臨床上早期確診率低、誤診率高[24]，應引起臨床醫(yī)師的重視。目前，經(jīng)過多年有效防治我國的血防工作取得了舉世矚目的成績，大部分血吸蟲病流行區(qū)已經(jīng)被消滅或控制，但形勢依然嚴峻[25-27]。目前我國許多血吸蟲病流行地區(qū)處于低度傳播或低度流行狀態(tài)，這種流行態(tài)勢對目前流行區(qū)常用診斷方法的可靠性提出了挑戰(zhàn)，并對現(xiàn)有診斷方法的改進或新診斷方法的研發(fā)提出了新的需求。現(xiàn)階段需要更高敏感性、特異性的診斷方法，為血吸蟲病的診斷、治療和療效考核提供依據(jù)，為及時修訂與出臺相應的防控策略提供保障。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.030

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)13-1824-03

(收稿日期：2016-03-02修回日期：2016-05-12)

△通訊作者,E-mail：421981727@qq.com。

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