江婉蓉 王珍 何遵衛(wèi)

人凝血因子Ⅷ在基因工程中的研究進(jìn)展

江婉蓉 王珍 何遵衛(wèi)

目的 因原料血漿不足，作為治療血友病A的唯一有效用藥人凝血因子Ⅷ資源短缺，而運(yùn)用基因工程生產(chǎn)的重組人凝血因子Ⅷ能很好的解決這些問題。本文從人凝血因子Ⅷ的結(jié)構(gòu)改造、載體及表達(dá)系統(tǒng)、基因治療和前沿基因編輯技術(shù)的應(yīng)用等幾個方面對FⅧ在基因工程中的研究進(jìn)行總結(jié)及展望。

重組人凝血因子Ⅷ；基因工程；基因治療

人凝血因子Ⅷ作為治療凝血障礙性疾病血友病A的惟一有效用藥，主要有兩個來源。一是血漿離心后獲得的冷沉淀中分離的人凝血因子Ⅷ(coagulation factor Ⅷ，F(xiàn)Ⅷ)；二是通過基因改造獲得的重組人凝血因子Ⅷ(recombinant FⅧ，rFⅧ)。而利用基因工程手段生產(chǎn)的rFⅧ相比于FⅧ具有以下優(yōu)勢：(1)不受原料血漿產(chǎn)量的限制；(2)患者接受治療后感染病毒性肝炎和艾滋病等傳染性疾病的風(fēng)險更低；(3)產(chǎn)品的穩(wěn)定性更強(qiáng)。李文卿[1]研究證實(shí)了重組人凝血因子Ⅷ在中國血友病A患者的治療中具有較好的有效性、安全性及較低的抑制物產(chǎn)生率。所以，面對國內(nèi)凝血因子Ⅷ短缺、進(jìn)口國外的基因重組凝血因子產(chǎn)品價格相對昂貴的困境，提高凝血因子Ⅷ的產(chǎn)量和利用率是一方面，另外對重組人凝血因子Ⅷ的研究和開發(fā)，生產(chǎn)中國自己的人重組凝血因子Ⅷ的產(chǎn)品，具有廣闊的應(yīng)用前景和積極的意義。本文從人凝血因子Ⅷ的結(jié)構(gòu)改造、載體及表達(dá)系統(tǒng)、基因治療和前沿基因編輯技術(shù)的應(yīng)用等幾個方面對FⅧ在基因工程中的研究進(jìn)行總結(jié)。

1 人凝血因子Ⅷ的結(jié)構(gòu)及其改造

1.1 人凝血因子Ⅷ的結(jié)構(gòu) 自Wood等[2]克隆人凝血因子Ⅷ的基因，解析了該基因的cDNA序列，并成功表達(dá)提取rFⅧ以來，F(xiàn)Ⅷ的基因和蛋白結(jié)構(gòu)逐漸被人們所探知。FⅧ的基因由26個外顯子和25個內(nèi)含子組成，其中14和26兩個外顯子最大，分別為3 106 bp和1 958 bp，全長186 kb，位于X染色體長臂末端，約占整個X染色體的0.1%。FⅧ基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、剪切后的mRNA長約9 kb，編碼一條包含2 351個氨基酸殘基的前體。信號肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被水解后，形成含有2 332個氨基酸殘基，6個結(jié)構(gòu)域的成熟FⅧ單鏈蛋白。

根據(jù)FⅧ內(nèi)部序列的同源性的關(guān)系，F(xiàn)Ⅷ可分為A、B、C三種結(jié)構(gòu)域,其中：A結(jié)構(gòu)域可分為A1、A2、A3三種，每個約含350個氨基酸殘基，具有30%的同源性，A1、A2位于重鏈，A3位于輕鏈；B結(jié)構(gòu)域為重鏈，位于分子的中部，共有908個氨基酸殘基；C結(jié)構(gòu)域位于輕鏈的C端，分為C1、C2，每個約有150個氨基酸殘基，具有40%的同源性。Stoilova-McPhie等[3]通過電子顯微鏡技術(shù)成功得到了FⅧ的晶體結(jié)構(gòu)。FⅧ的A3區(qū)位于細(xì)胞膜磷脂雙分子層且緊鄰C1和C2區(qū)；C1區(qū)的長軸與細(xì)胞膜平面大約平行且與C2幾乎垂直；A1、A2和A3區(qū)之間互有微小角度且均有2個高度保守的β桶裝結(jié)構(gòu)域。整個分子排列成A1-A2-B-A3-C1-C2[4]。通過與細(xì)胞內(nèi)外的多種結(jié)構(gòu)的蛋白和酶之間復(fù)雜的相互作用，從而影響著FⅧ的蛋白質(zhì)活性、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和基因表達(dá)等。

1.2 人凝血因子Ⅷ結(jié)構(gòu)的改造 盡管重組人凝血因子Ⅷ對于血友病A患者的治療效果顯著，但因人凝血因子Ⅷ的基因較大，表達(dá)水平低和極易降解等缺陷，尋找合適的途徑和表達(dá)載體顯得尤為重要。通過對FⅧ基因結(jié)構(gòu)的改造，能有效的提高FⅧ在細(xì)胞中的表達(dá)。當(dāng)前，對于對FⅧ基因結(jié)構(gòu)的改造有以下幾個方面：(1)缺失B區(qū)：FⅧ的B區(qū)結(jié)構(gòu)域占整個分子的大約40%，但B區(qū)缺失型FⅧ與野生型FⅧ具有相似的生物學(xué)特征，F(xiàn)Ⅷ基因的B區(qū)在加工的過程中被剪切，其與基因表達(dá)和凝血功能等關(guān)系不大。且B區(qū)缺失型FⅧ沒有載體包裝容量的的缺陷，表達(dá)產(chǎn)物也更為簡單朱甫祥等[5]研究了將FⅧ基因在大腸桿菌中分別表達(dá)的重鏈和輕鏈，利用內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白剪切法進(jìn)行拼接。隨后，將促進(jìn)重鏈分泌的基因區(qū)導(dǎo)入其中，經(jīng)雙載體共轉(zhuǎn)染的方式，獲得了高活性和高表達(dá)量的B區(qū)缺失型FⅧ。Pittman等[6]將FⅧcDNA的若干結(jié)構(gòu)域去除后獲得的B區(qū)缺失型FⅧcDNA插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，基因的表達(dá)量不僅比野生型有較大程度提高，而且表達(dá)產(chǎn)物的生物特性及免疫原性與野生型相同。另外，美國輝瑞、韓國綠十字等幾家醫(yī)藥公司已有B區(qū)缺失或保留B區(qū)部分氨基酸的重組FⅧ成功上市[7]。(2)定點(diǎn)突變：通過對氨基酸位點(diǎn)的定點(diǎn)突變，減少FⅧ在分泌途中與相關(guān)蛋白結(jié)合，從而提高其表達(dá)量；通過特定結(jié)構(gòu)改造的FⅧ能抵制特定蛋白對其作用位點(diǎn)接切后的抑制，增強(qiáng)了FⅧ的穩(wěn)定性。Wakabayashi等[8]通過對包埋在分子內(nèi)部、帶電荷較多的4個位點(diǎn)進(jìn)行突變，突變產(chǎn)物相比于野生型的凝血活性和熱穩(wěn)定性均有很大程度的提高。細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用會抑制FⅧ的表達(dá)。 Miao等[9]設(shè)計了F309S的突變位點(diǎn)，降低FⅧ在分泌過程中與BiP的相互作用；有研究表明通過突變2個半胱氨酸的位點(diǎn)，消除了二硫鍵對分泌蛋白的影響，表達(dá)量均有顯著提高[10]。(3)聚乙二醇修飾：聚乙二醇修飾又稱PEG化，是將活化的聚乙二醇與蛋白質(zhì)分子相偶聯(lián)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)各種生物化學(xué)性質(zhì)的改變。通過PEG化，能增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子化學(xué)穩(wěn)定性，提高抵抗蛋白酶水解能力，降低蛋白免疫原性及延長蛋白在體內(nèi)的半衰期。

進(jìn)行PEG化的半胱氨酸殘基在B區(qū)缺失型FⅧ中一共含有19個，其中16個以二硫鍵相互配對，另外3個包埋在分子內(nèi)部。所以需要通過定點(diǎn)突變等方法引入新的半胱氨酸殘基進(jìn)行PEG化。Mei等[11]研究了不同位點(diǎn)引入單個半胱氨酸殘基進(jìn)行PEG化，結(jié)果表明，大多數(shù)經(jīng)過PEG化的FⅧ突變體的生物活性與野生型效果相同，且在半衰期和治療效果均優(yōu)于野生型FⅧ。另外，在B區(qū)還有4個半胱氨酸殘基，Turecek等[12]通過對重組全長的FⅧ進(jìn)行定點(diǎn)PEG化，大部分修飾位點(diǎn)處于B區(qū)，經(jīng)PEG化的FⅧ的結(jié)構(gòu)和功能沒有影響。因此，PEG化作為一個有效的手段，拜耳、百特等醫(yī)藥公司已有相關(guān)的定點(diǎn)氨基酸PEG化的重組FⅧ進(jìn)入臨床，以后將會給血友病A患者帶來福音[7]。

另外，為延長重組FⅧ的半衰期，在FⅧ末端和B區(qū)缺失的FⅧ末端融合表達(dá)IgG的Fc片段；利用PEG化脂質(zhì)體非共價包裹FⅧ等。FⅧ作為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)藥物，隨著對FⅧ結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，將會研制出高效、安全、價廉的重組FⅧ產(chǎn)品。

2 重組FⅧ的表達(dá)載體及系統(tǒng)

通常的載體有三種，細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒。它們是一類能將目的基因轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的一種能自我復(fù)制的DNA或RNA分子。在重組FⅧ載體的構(gòu)建中，這三種類型均有所應(yīng)用，細(xì)菌質(zhì)粒和動物病毒的應(yīng)用更為普遍。病毒載體以其宿主范圍廣、載體容量大及操作簡單等優(yōu)勢得到廣泛應(yīng)用，腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒及單純皰疹病毒等病毒載體均有相關(guān)研究報道。

表達(dá)系統(tǒng)中，原核生物表達(dá)系統(tǒng)操作簡便，卻在表達(dá)真核來源的重組FⅧ蛋白時存在一些缺陷，如二硫鍵的錯誤鏈接、肽鏈不能有效折疊及糖基化效率低等問題，故應(yīng)用并不廣泛?，F(xiàn)今的研究關(guān)注更多的是真核微生物和動物細(xì)胞類的表達(dá)載體，王澤[13]將分泌性載體Ppic9導(dǎo)入甲醇誘導(dǎo)性畢赤酵母中進(jìn)行重組FⅧ的表達(dá)，成功的表達(dá)出重組FⅧ，為重組FⅧ表達(dá)系統(tǒng)的擴(kuò)展研究提供基礎(chǔ)。孫夏瑜[14]通過克隆FⅧ基因的cDNA，利用桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)成功地制備了具有凝血活性的重組FⅧ。趙倩[15]通過構(gòu)建含有BDDh FⅧ的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞中，得到了能穩(wěn)定表達(dá)重組FⅧ的細(xì)胞株。生產(chǎn)應(yīng)用最多的表達(dá)系統(tǒng)還是中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，通過載體轉(zhuǎn)染CHO，細(xì)胞培養(yǎng)后，通過親和層析等蛋白分離技術(shù)獲得重組FⅧ，有些產(chǎn)品已成功上市。

3 基因治療

血友病A的主要發(fā)病機(jī)制是內(nèi)含子22的倒位和錯義突變。隨著科學(xué)家對FⅧ基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的透徹研究，加之個體對FⅧ的正常生理水平要求較低，許多器官均能產(chǎn)生有活性的FⅧ。因此，血友病A作為體細(xì)胞基因治療的首選疾病。

3.1 體外治療 體外治療指的是先從患者體內(nèi)取出某一組織的細(xì)胞，通過體外擴(kuò)增培養(yǎng)后，將攜帶有重組FⅧ基因的載體轉(zhuǎn)染到受體細(xì)胞中，篩選出轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞移植到患者體內(nèi)，進(jìn)而通過這些移植的細(xì)胞表達(dá)出FⅧ來達(dá)到治療的目的。Van Damme等[16]將攜帶有B區(qū)缺失型FⅧ的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染至人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞中，然后將成功轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞移植到免疫缺陷的NOD-SCID小鼠中，重組FⅧ在小鼠體內(nèi)的表達(dá)量對于治療有顯著價值。因病毒載體的不安全性，纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞等取材方便、體外擴(kuò)增迅速的組織細(xì)胞在臨床中得到應(yīng)用。

3.2 體內(nèi)治療 體內(nèi)治療是指將能表達(dá)FⅧ的載體直接注入患者機(jī)體。目前最為安全的治療方法是向患者體內(nèi)直接注射不含載體的裸DNA，通過體內(nèi)肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，自身表達(dá)FⅧ來進(jìn)行治療，這是一個比較有效的體內(nèi)治療方法。另外，通過轉(zhuǎn)座子對哺乳動物基因的高效整合，將真核生物的含有FⅧ基因轉(zhuǎn)座子載體導(dǎo)入受體體內(nèi)，表達(dá)FⅧ達(dá)到治療目的。但因轉(zhuǎn)座子整合基因位置的不確定，這種方法的安全性還需進(jìn)一步驗證。劉雄昊[17]通過構(gòu)建攜帶有h FⅧ-SK39的核糖體基因區(qū)靶向表達(dá)載體電轉(zhuǎn)染至人肝細(xì)胞中，采用高水壓注射法將載體直接通過尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示該載體在小鼠體內(nèi)得到有效表達(dá)，這為血友病的基因治療開拓了新的思路并奠定了基礎(chǔ)。

不得不提的是，隨著最近幾年一種全新的基因編輯技術(shù)CRISPR(規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列)的誕生，科學(xué)家只需要設(shè)計一段幾十個堿基的CRISPR，利用靶點(diǎn)特異性的RNA將Cas9核酸酶帶到基因組的具體靶點(diǎn)上，便能對特定基因位點(diǎn)進(jìn)行切割導(dǎo)致突變。這項技術(shù)應(yīng)用在基因敲除、基因編輯相關(guān)的疾病、基因的激活和表達(dá)等多個領(lǐng)域。CRISPR/Cas9還可以作為一種精確的基因剪切工具運(yùn)用在真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中。將CRISPR/Cas9應(yīng)用在重組FⅧ的研究中，不僅能簡化基因編輯操作步驟，更重要的是其精準(zhǔn)的定位能極大了提高重組效率，減少因剪切帶來的基因片段的殘留或缺失，這可以提高轉(zhuǎn)染成功率，同樣在表達(dá)系統(tǒng)中能使表達(dá)的重組FⅧ正確折疊，進(jìn)而提高重組FⅧ收率。CRISPR/Cas9在血友病A的基因治療方面同樣有革命性的應(yīng)用前景，相信將這項技術(shù)應(yīng)用在重組FⅧ的研究中將具有深遠(yuǎn)的意義。

在我國30多家血液制品生產(chǎn)廠家中僅有4家生產(chǎn)人凝血因子Ⅷ，且還沒有國內(nèi)公司生產(chǎn)重組FⅧ的產(chǎn)品，產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足血友病患者的需求，進(jìn)口的重組FⅧ以其安全、高效的優(yōu)勢已被越來越多的血友病患者所接受。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，相信在不久的將來，現(xiàn)今存在的受體產(chǎn)生免疫反應(yīng)、插入突變及CRISPR/ Cas9的脫靶等問題將會得到解決，重組FⅧ的永久性表達(dá)的也將會實(shí)現(xiàn)。

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17 劉雄昊.利用攜帶人凝血因子Ⅷ的核糖體基因區(qū)打靶載體進(jìn)行血友病A基因治療的研究.中南大學(xué),2007.23.

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.24.035

430000 湖北省武漢市中醫(yī)醫(yī)院(江婉蓉)；武漢中原瑞德生物制品有限責(zé)任公司(王珍、何遵衛(wèi))

R 349.83

A

1002-7386(2016)24-3800-03

2016-04-12)