王正遠 綜述 韓江全 審校

(遵義醫(yī)學院第五附屬(珠海)醫(yī)院，廣東 珠海 519100)

?

Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路與腦缺血后細胞凋亡

王正遠 綜述 韓江全△審校

(遵義醫(yī)學院第五附屬(珠海)醫(yī)院，廣東 珠海 519100)

Wnt； β-鏈蛋白； 糖原合成酶激酶-3β； 腦缺血； 細胞凋亡

腦缺血損傷機制極為復雜，炎癥、氧化應(yīng)激以及凋亡各種損傷因素均與缺血性腦損傷及損傷擴大的過程相關(guān)。由于細胞凋亡主要發(fā)生在梗死區(qū)周圍的缺血半暗帶區(qū)，凋亡神經(jīng)元的多寡直接決定著神經(jīng)元壞死數(shù)量和梗死區(qū)域的面積，因此，細胞凋亡在腦缺血損傷中起著重要作用，及時有效的抗凋亡措施，有望成為缺血性卒中的有效治療方法[1]。信號轉(zhuǎn)導通路在細胞凋亡中扮演著關(guān)鍵的角色。研究表明，腦缺血后，與凋亡有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導通路主要包括磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(Akt)信號通路，Wnt/β-catenin信號通路等。其中，Wnt/β-catenin為抑制細胞凋亡和促進細胞存活的重要信號轉(zhuǎn)導通路[2-3]，而作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)下游的重要蛋白，GSK-3β在腦缺血中發(fā)揮著促凋亡作用[4-5]。

1 Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路的重要原件和功能

1.1 Wnt及其功能 Wnt是一個復雜的大家族。Wnt基因編碼的蛋白為分泌型糖蛋白，一般情況下長度在350-400個氨基酸，Wnt蛋白是指Wnt信號通路中的配體蛋白，其可與細胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，進而激活各級傳導分子，最終調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯[6]。哺乳動物體內(nèi)的19種Wnt蛋白被分成Wnt1組和Wnt5a組兩大類，Wnt1組有Wnt1、Wnt3、Wnt10等以Wnt/β-catenin信號通路(也稱為經(jīng)典Wnt信號通路)傳遞分子信息，Wnt5a組包括Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a等，以非依賴β-catenin信號通路(也稱為非經(jīng)典Wnt信號通路)傳導傳遞分子信息[7]。

1.2 β-catenin及其功能 β-catenin是Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路中起關(guān)鍵作用的一種蛋白質(zhì)，β-catenin蛋白由781個氨基酸組成，分子量約為90KD，其肽鏈中部有12～14個各由42個氨基酸殘基組成的重復序列(稱arm區(qū)域)，該區(qū)域可以和E-cadherin、APC蛋白、TCF、上皮生長因子(EGFR)等蛋白結(jié)合而發(fā)揮多種功能。β-catenin的氨基末端有數(shù)個GSK-3β和酪氨酸蛋白激酶的磷酸化位點。這些位點的磷酸化與去磷酸化。對β-catenin的功能轉(zhuǎn)換起重要調(diào)控作用。[8]

1.3 Wnt/β-catenin信號通路 未受到刺激的情況下，細胞內(nèi)Wnt信號幾乎不表達。在各種原因?qū)е耊nt蛋白表達增加時，Wnt信號通路活化，Wnt蛋白結(jié)合到Frizzled蛋白(跨膜受體卷曲蛋白)和輔助受體LRP5/6(低密度脂蛋白受體家族)后，活化細胞內(nèi)Dvl蛋白(散亂蛋白，Dishevelled)，Dvl蛋白的活化抑制了細胞質(zhì)內(nèi)由糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、APC、軸蛋白(Axin)等組成的復合物的活性，導致未磷酸化的β-catenin在細胞內(nèi)聚集并轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，并與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF相結(jié)合形成復合物，引起轉(zhuǎn)錄激活，促進細胞保護性靶蛋白分子如survivin、Bcl-2、血管內(nèi)皮生長因子( VEGF ) 等的轉(zhuǎn)錄表達[9]以及維持細胞的 DNA 完整性及細胞膜磷脂分子的極性，從而發(fā)揮阻止細胞凋亡、促進細胞再生的功能，在各器官組織中維持其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等的保護功能?？傊琖nt是細胞內(nèi)的重要蛋白分子，與神經(jīng)細胞的發(fā)育、存活、凋亡以及神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生等多種生物學事件有關(guān)。DKK-1作為Wnt通路重要拮抗劑，在局灶性腦缺血模型中廣泛誘導[3]。DKK-1可以競爭性結(jié)合LRP5/6，此外DKK-1還可以與Kremen、LRP5/6形成三聚體，導致快速內(nèi)吞而減少質(zhì)膜上的LRP5/6從而阻止Wnt-Frizzled復合物形成，最終β-catenin被磷酸化而不能與核內(nèi)LEF/TCF結(jié)合，從而抑制下游基因表達。

2 GSK-3β信號轉(zhuǎn)導通路

2.1 GSK-3β及其功能 哺乳動物GSK-3包括2種亞型-GSK-3α和GSK-3β，二者的激酶結(jié)構(gòu)序列幾乎一致，主要不同點在于其N-末端與C-末端。GSK-3α廣泛分布于真核細胞，GSK-3β則選擇性表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此該亞型與腦內(nèi)功能高度相關(guān)。GSK-3β通常在預磷酸化的底物下被磷酸化的。GSK-3β通過位于激酶端的酪氨酸殘基216(Tyr216)磷酸化而激活，通過氨基末端的絲氨酸殘基9(Ser-9)的磷酸化而抑制。GSK-3β參與許多細胞過程，包括胰島素和Wnt/wingless信號通路。

2.2 PTEN/PI3K/Akt/GSK-3β信號通路 GSK-3β的活性通過胰島素信號的調(diào)節(jié)而減弱。具體而言，胰島素可激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，一方面增加抗凋亡蛋白的表達，另一方面抑制促凋亡蛋白的活性。PI3K通過磷酸化方式激活下游靶蛋白Akt/蛋白激酶B。磷酸化Akt(pAkt)緊接著磷酸化并抑制GSK-3β。然而，當應(yīng)激時，細胞死亡是誘導和激活磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)，細胞內(nèi)一個3’-磷酸酶，依次傳遞給PI(3,4)P2，PI(4)P， PI(3,4,5)P3 ，PI(4,5)P2，同時激活的PTEN通過抑制PI(3,4,5)P3抑制PI3K。失活的PI3K不能磷酸化Akt,同時pAkt的減少降低了GSK-3β的磷酸化，所有這些使GSK-3β活化[10-11]。激活的GSK-3β抑制熱休克轉(zhuǎn)錄因子-1(HSTF-1),導致線粒體死亡途徑，細胞色素C從線粒體釋放。最后，釋放的線粒體通過激活caspase-9和caspase-3導致細胞凋亡[12]。

2.3 GSK-3β和線粒體內(nèi)源性凋亡途徑 線粒體集成不同的信號通路，參與多個細胞過程，包括細胞凋亡。線粒體最主要的特征是在活細胞中，維持膜電位和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的低電導狀態(tài)(mPTP)。mPTP的激活是線粒體介導內(nèi)源性細胞凋亡的中心事件[13]。細胞死亡的mmPTP途徑是通過線粒體膜的破壞和凋亡相關(guān)分子的釋放介導的，這可以通過GSK-3β信號通路調(diào)節(jié)mPTP的開放。GSK-3β對細胞死亡和生存與它控制許多蛋白的線粒體定位和激活有關(guān)，尤其是B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白，包括Bax，Bcl-2和Mcl-1，在mPTP形成中有重要地位[14]。通常而言，Bax作為胞漿蛋白，在凋亡信號刺激下，轉(zhuǎn)運到線粒體膜上。一旦位于線粒體膜，Bax可以螯合Bcl-2并在線粒體膜上聚合，導致促凋亡分子釋放到細胞質(zhì)中。相反地，Bcl-2和Mcl-1作為抗凋亡成員，保護線粒體膜的完整性，從而阻止抗凋亡分子的釋放和細胞凋亡的發(fā)生。GSK-3β的激活通過上調(diào)Bax表達水平促進線粒體介導的凋亡。鋰鹽治療，作為GSK-3β的藥源性抑制劑，可以通過降低Bax表達水平，抑制促凋亡通路，而通過提高Bcl-2表達促進抗凋亡通路[15]。此外，GSK-3β可以通過直接磷酸化BAX蛋白的Ser163位點促進該蛋白的線粒體定位[16]。 GSK-3β磷酸化Mcl-1的Ser159位點，導致這種蛋白的失衡，以至于封堵Mcl-1，使得其不能結(jié)合到線粒體膜上。總而言之，GSK-3β通過線粒體凋亡途徑，在控制細胞死亡和生存上占有重要的地位。

3 Wnt/β-catenin通路與腦缺血后神經(jīng)元凋亡

腦缺血刺激下會打破生理狀態(tài)下Wnt/β-ctenin和GSK-3β通路轉(zhuǎn)導信號的平衡，導致神經(jīng)元凋亡。

3.1 Wnt/β-catenin信號通路與腦缺血再灌注損傷 學者L.Doubravska等[17]發(fā)現(xiàn)初級海馬神經(jīng)元Wnt1瞬時過表達以及重組Wnt1蛋白的注射，都可以使初級海馬神經(jīng)元及大腦皮層免受氧化應(yīng)激損傷。早期的研究發(fā)現(xiàn)，與淋巴細胞共培養(yǎng)的成纖維細胞過表達Wnt1能使淋巴細胞免于凋亡。

3.2 GSK-3β與腦缺血再灌注損傷 S.Kelly[18]等學者利用GSK-3β選擇性抑制劑Chir025研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β活性降低能使神經(jīng)元免受糖氧剝離損害,谷氨酸毒性以及腦缺血損害。

4 神經(jīng)保護干預因素的作用機制與Wnt/GSK-3β/β-catenin信號通路

Q.G.Zhang[19]等的研究表明，腦缺血時給予保護性干預藥物如雌激素會減少DKK-1的生成，提高Wnt/β-catenin信號通路的活性，增加終產(chǎn)物β-catenin的含量。Y.Xing[20]等的研究表明，神經(jīng)保護劑舒林酸能活化Wnt/β-catenin信號通路，高劑量的舒林酸可使p-β-catenin表達降低，促凋亡蛋白BAX表達下降，抗凋亡蛋白Bcl-2表達升高，減輕腦水腫及腦梗死體積。

5 展 望

Wnt/β-catenin信號通路具有明確的抗凋亡作用，其激活劑不斷深入研究，為腦血管病治療提供新的靶點。GSK-3β即可以為Wnt/β-catenin通路的一部分，也可通過Akt/GSK-3β、胰島素/GSK-3β發(fā)揮作用，GSK-3β抑制劑的研究也為腦血管病治療提供新的靶點。目前，關(guān)于Wnt/β-catenin及GSK-3β的研究多集中在缺血再灌注損傷方面，對于超負荷血糖對鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡的研究較少。韓江全[21]等研究表明上調(diào)FADD、Daxx表達，促進細胞凋亡可能是超負荷血糖加重腦缺血再灌注損傷的機制之一。Fas相關(guān)死亡域蛋白(fas-associated with death domain protein，F(xiàn)ADD)是死亡受體介導的凋亡途徑關(guān)鍵的啟動子，在細胞凋亡中起著極為重要的作用[22]。死亡域相關(guān)蛋白(death domain associated protein，Daxx)是一種多功能的核蛋白，可多途徑的促進細胞凋亡[23]，Wnt/β-catenin信號通路與FADD及DaXX在超負荷血糖加重腦缺血再灌注損傷關(guān)系有待進一步研究。

[1] Mehta SL, Manhas N, Raghubir R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics[J].Brain Res Rev, 2007, 54 (1): 342-661

[2] Lei ZN, Zhang LM, Sun FY. Beta-catenin siRNA inhibits ischemia induced striatal neurogenesis in adult rat brain following a transient middle cerebral artery occlusion[J]. Neurosci Lett, 2008, 435(2)：108-112.

[3] Mastroiacovo F，Busceti CL，Biagioni F，et a1．Induction of the Wnt antagonist，Dickkopf-1，contributes to the development of neuronal death in models of brain focal ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab，2009,29(2):264-276.

[4] Endo H, Nito C, Kamada H, et al. Activation of the Akt/GSK3β signaling pathway mediates survival of vulnerable hippocampal neurons after transient global cerebral ischemia in rats[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2006, 26: 1479-1489.

[5] Zhao H, Shimohata T, Wang JQ, et al. Akt contributes to neuroprotection by hypothemia against cerebral ischema in rats[J]. J Neurosci,2005,25: 9794-9806.

[6] Angers S，Moon RT．Proximal events in Wnt signal transduction[J]．Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10(7)：468-477．

[7] Baksh D，Boland GM，Tuan RS．Cross-talk between Wnt signaling pathways in human mesenchymal stem cells leads to functional antagonism during osteogenic differentiation[J]．J Cell Biochem，2007，101(5)：1109-1124．

[8] Peifer M,Polakis P. Wnt signaling in oncogenesis and embryogenesis-a look outside the nucleus.[J].Science,2000,287(5458)：1606.

[9] Liebner S, Corada M，Bangsow T．Wnt/beta-catenin signaling controls development of the blood-brain barrier[J]．J Cell Biol，2008,183(3):409-417.

[10] Watcharasit P, Bijur GN, Song L, et al. Glycogen synthase kinase-3beta (GSK3beta) binds to and promotes the actions of p53[J]. Journal of Biological Chemistry,2003,278(49):48872-48879.

[11] Bijur GN, Jope RS. Opposing actions of phosphatidylinositol 3-kinase and glycogen synthase kinase-3β in the regulation of HSF-1 activity[J].Journal of Neurochemistry,2000,75(6):2401-2408.

[12] Cantley LC. The phosphoinositide 3-kinase pathway[J].Science,2002,296(5573):1655-1657.

[13] Perier C, Tieu K, Guegan C, et al.Complex I deficiency primes Bax-dependent neuronal apoptosis through mitochondrial oxidative damage[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2005，102:19126-19131.

[14] Linseman DA, Butts BD, Precht TA, et al.Glycogen synthase kinase-3beta phosphorylates Bax and promotes its mitochondrial localization during neuronal apoptosis[J]. J Neurosci，2004，24:9993-10002.

[15] Chen G, Zeng WZ, Yuan PX, et al.The mood-stabilizing agents lithium and valproate robustly increase the levels of the neuroprotective protein bcl-2 in the CNS[J]. J Neurochem,1999,72:879-882.

[16] Linseman DA, Butts BD, Precht TA, et al.Glycogen synthase kinase-3beta phosphorylates Bax and promotes its mitochondrial localization during neuronal apoptosis[J]. J Neurosci,2004,24:9993-10002.

[17] Doubravska L, Simova S, Cermak L,et al. Wnt-expressing rat embryonic fibroblasts suppress Apo2L/TRAIL-induced apoptosis of human leukemia cells[J]. Apoptosis,2008,13:573-87.

[18] Kelly S，Zhao H，Hua Sun G，et a1．Glycogen synthase kinase-3beta inhibitor Chir025 reduces neuronal death resulting from oxygen-glucose deprivation，glutamate excitotoxicity，and cerebral ischemia[J]．Exp Neurol，2004，188(2)：378-386．

[19] Zhang QG，Wang R，Khan M，et a1．Role of Dickkopf-1，an antagonist of the Wnt/beta-catenin signaling pathway， in estrogen-induced neuroprotection and attenuation of tau phosphorylation[J]．J Neurosci，2008，28：8430,8441

[20] Xing Y ,,Zhang X, Zhao K,et al.Beneficial effects of sulindac in focal cerebral ischemia：A positive role in Wnt/β-catenin pathway[J]. Brain Res,2012,30:71-80.

[21] 韓江全，吳俊雄，胡泳濤,等.超負荷血糖對鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡及FADD、Daxx表達的影響[J].貴州醫(yī)藥.2012,3(36)：195-200.

[22] Chinnaiyan AM，O’Rourke K，Tewari M，et a1．FADD，a novel death domain-containing protein，interacts withthe death domain of Fas and initiates apoptosis[J]．Cell，1995，81：505-512．

[23] Yang X，Khosravi-Far R，Chang HY，et al．Daxx，a novel Fas-binding protein that activates JNK and apoptosis[J]．Cell，1997，89：1067-1076．

貴州省衛(wèi)生計生委科學技術(shù)基金項目(gzwjkj2014-2-157)；珠海市重點學科項目(珠衛(wèi)2013070)

R743.3

B

1000-744X(2016)03-0316-04

2015-11-03)

△通信作者,E-mail: gdshanjq@163.com