吳成軍 王錫英 江金燕 許曉雅 潘德標(biāo) 葉冠雄

溫州醫(yī)學(xué)院附屬第六醫(yī)院浙江省麗水市人民醫(yī)院普外科 浙江麗水 32300

NPRL2與肝細(xì)胞癌大小相關(guān)性研究

吳成軍 王錫英 江金燕 許曉雅 潘德標(biāo) 葉冠雄

溫州醫(yī)學(xué)院附屬第六醫(yī)院浙江省麗水市人民醫(yī)院普外科 浙江麗水 32300

目的：NPRL2在肝細(xì)胞癌大小相關(guān)性。方法：收集本院手術(shù)切除的HCC組織標(biāo)本56例,按肝癌大小分組：甲組≤2cm，乙組＞2cm ≤5cm，丙組＞5cm，采用熒光定量PCR法檢測(cè)NPRL2蛋白和mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果：肝癌組織中NPRL2蛋白和NPRL2 mRNA的表達(dá)在丙組最高。結(jié)論：在肝癌中NPRL2 mRNA和蛋白水平較與腫瘤大小成正相關(guān)。

肝癌；抑癌基因；NPRL2

抑癌基因NPRL2（nitrogen permease regulator like 2）也稱腫瘤抑制候選基因4（tumor suppressor candidate 4,TUSC4）,廣泛存在于人體各種組織中，定位于人染色體3p21.3區(qū)域，Kok等[1]認(rèn)為在該區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)乃至多個(gè)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的抑癌基因。 Lerman等[2]從人 3號(hào)染色體短壁上克隆得到抑癌基因 NPRL2（nitrogen permease regulator like 2），研究發(fā)現(xiàn)該基因的失活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，但其具體的抑癌機(jī)制尚不明確。 研究發(fā)現(xiàn)，人類多種腫瘤組織（如肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、卵巢癌和腎癌等）中的表達(dá)明顯降低。但其與肝細(xì)胞肝癌的的關(guān)系研究甚少。本文研究探討NPRL2在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)情況與腫瘤大小關(guān)系，采用熒光定量PCR法檢測(cè)NPRL2蛋白和mRNA的表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象：收集本院手術(shù)切除的HCC組織標(biāo)本56例（經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌,所獲標(biāo)本均獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)書及患者知情同意書）。所有患者術(shù)前均未接受過放射治療和化學(xué)治療。新鮮組織在手術(shù)后立即去掉壞死組織、血塊，將收集的標(biāo)本分2份，1份30min內(nèi)以液氮保存，并放入-80℃冰箱中保存，另1份放入4%多聚甲醛溶液固定。

主要試劑：免疫組化化學(xué)試劑盒購(gòu)自上海生工生物有限公司，NPRL2鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，超敏SP試劑盒、DAB均購(gòu)自上海Genetech公司，Trizol總RNA抽提試劑盒購(gòu)自上海生工生物公司，逆轉(zhuǎn)錄酶（MMLV-RT）購(gòu)自美國(guó) Promega公司，Real-time PCR專用Sybergreen 熒光染料購(gòu)自美國(guó) Biorad 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法:

熒光定量PCR檢測(cè)NPRL2 mRNA的表達(dá)：采用引物設(shè)計(jì)軟件（Primer 5.0）進(jìn)行引物序列設(shè)計(jì)：NPRL2 上游引物：5 -CAGGGGTTACAGACTTGGGT-3ˊ，下 游 引 物 : 5 -TGTAACTGGGCTTGGTGAT-3 ,內(nèi)參基因 GAPDH上游引物：5 -GAGACACCGCTCTTCTTG-3ˊ，下游引物：5 -TGACTGTCCGTTGAACTTG-3ˊ。按Trizol 常規(guī)法抽提組織總 RNA ,去除基因組DNA，RNA定量后逆轉(zhuǎn)錄；取才cDNA 1μl 進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)；分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，出示實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

1.3 標(biāo)本分組情況

甲組≤2cm，12例；乙組＞2cm ≤5cm，28例；丙組＞5cm，16例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析檢驗(yàn)組間差異的顯著性。計(jì)數(shù)資料以陽性率表示，采用卡方檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

肝癌組織中NPRL2蛋白的檢測(cè)：

肝癌組織中NPRL2 mRNA的表達(dá)：各樣本的擴(kuò)增曲線呈線性關(guān)系，溶解曲線呈單峰。丙組，乙組和甲組NPRL2基因的表達(dá)水平分別是：1.732±0.253、 4.043±0.362和5.123±0.182（P＜0.5）。

3 討論

NPRL2生物間有高度保守性，小鼠的NPRL2蛋白有97%和人類相同。研究證實(shí)，NPRL2在許多正常組織中均有表達(dá)，如：肝臟、腎臟、肺和胰腺。而在許多腫瘤中表達(dá)明顯降低，如肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、卵巢癌和腎癌等。研究結(jié)果證實(shí)，該基因與DNA錯(cuò)配修飾、細(xì)胞周期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞凋亡途徑密切相關(guān)。這些研究提示，NPRL2基因能有效干擾多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其可能在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，NPRL2蛋白的陽性信號(hào)主要定位于胞質(zhì)和（或）胞核中。在肝癌中NPRL2 mRNA和蛋白水平與腫瘤表達(dá)成正相關(guān)。

綜上所述，NPRL2在肝癌中表達(dá)情況與腫瘤大小成正相關(guān)，可以運(yùn)用在我們臨床工作中。

[1] Kok K.Nayler SL .Buys CH.Deletions of the short arm of chromosome 3 in solid tumors and the search for suppressor genes [J].Adv Cancer Res ,1997,71:27-92.

[2] Lerman MI.Minna JD.The 630-kb lung cancer homozygous deletion region on human chromosome 3p21.3; identification and evaluation of the resident candidate tumor suppressor gene[J].Cancer Res .2000.60(21):6116-6133.

R596.2

A

1672-5018（2016）12-028-01

浙江省麗水市科技局公益性資助項(xiàng)目 編號(hào)： 2013JYZB39。

吳成軍，男，（1974.3— ），四川鄰水人，醫(yī)學(xué)碩士，主任醫(yī)師，從事肝膽胰臨床及科研工作。