孫麗麗

哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠 150000

三七素檢測方法研究進(jìn)展淺談

孫麗麗

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在中藥三七中，其中的一個主要成分是三七素，三七素具有止血的成分，這種成分在山黧豆中居多，因此三七素又被稱為是山黧豆神經(jīng)毒素，本文重點(diǎn)對三七素的主要檢測方法進(jìn)行了研究，希望能夠?qū)窈蟮墓ぷ饔兴鶐椭?/p>

三七素；液相色譜；流動注射

在山黧豆中，能夠檢測出三七的成分，最早人們并沒有對三七素具有全面的了解，而是集中在神經(jīng)中毒方面的研究，這是一種古老的豆類成分，具有耐旱性的特點(diǎn)，在歷史上曾經(jīng)出現(xiàn)過幾次中毒事件，因此山黧豆的種植數(shù)量逐年遞減。我國對于山黧豆的種植已經(jīng)很少了，因?yàn)槠淠秃档奶攸c(diǎn)，所以地域較為干旱的地區(qū)還是有所種植的，比如西北地區(qū)、印度以及埃塞俄比亞等。為了專門探究山黧豆中毒的原因，印度最早開始了這方面的研究工作，在其中鑒定出了三七素，三七素具有止血的活性，在神經(jīng)毒方面也具有一定的作用，但是這兩個方面的復(fù)雜功效來看，還需要加以進(jìn)一步的研究，只有這樣才能將其應(yīng)用在更加有用的領(lǐng)域中。

1、傳統(tǒng)的檢測方法

在對三七素進(jìn)行檢測的過程中，合理的檢測方法十分重要，每種檢測方法都各有特點(diǎn)，下面筆者就簡單的介紹了幾種檢測方法。首先是傳統(tǒng)的檢測方法。三七素屬于氨基酸的一種，在最早的檢測過程中，主要是采用對氨基酸的通用方法，例如紙電泳以及薄層層析等方法，在這種情況下，使用茚三酮能夠顯示出顏色，再對其進(jìn)行測量。傳統(tǒng)的，高效薄層層析法能夠?qū)Σ煌哳^中的三七素含量進(jìn)行測量，并且得出三七素基本含量為 0.316%左右。還有一種檢測方法為“Rao法”，在檢測的過程中首先是要將三七素在水中進(jìn)行水解，然后得出相應(yīng)的產(chǎn)物，在乙硫醇中進(jìn)行反應(yīng)，得到有色復(fù)合物，在420nm下進(jìn)行對比測定三七素的最終含量。這些都是傳統(tǒng)的檢測方法，但是不足之處在于靈敏度相對較低，準(zhǔn)確度也不高。

2、高效液相色譜檢測法

2.1 間接（衍生化）檢測法

首先介紹的是一種間接檢測法，在上世紀(jì)80年代出現(xiàn)了對氨基酸進(jìn)行自動分析的儀器，這是在離子交換層析基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的一種檢測方法。隨著時代的發(fā)展，這一儀器得到了更加大范圍的使用，尤其是在對山黧豆中的三七素進(jìn)行檢測的過程中，可以很好的對其進(jìn)行測量，隨即又開發(fā)了全新的測量方法，就是使用柱后衍生化顯色法，這種方法主要是以高效液相色譜為基礎(chǔ)的一種方法，同時也應(yīng)用了紫外線等一些手段，在檢測的過程中，靈敏度得到顯著的提升，并且時間也得到了有效的控制，尤其是在分析的過程中，效果是十分明顯的。

在使用這一檢測方法的過程中，過去都是在 340nm的環(huán)境下進(jìn)行紫外線檢測的，或者是使用熒光檢測器進(jìn)行檢測，其作用在于能夠解決衍生物不穩(wěn)定的現(xiàn)象，在此基礎(chǔ)上使用 9芴基甲氧基碳酰氯作為主要的衍生試劑，在熒光下對三七素進(jìn)行檢驗(yàn)，針對這一檢測方法，相關(guān)人員對幾種不同的三七頭進(jìn)行了提取，檢驗(yàn)其中三七素的含量，得到結(jié)果是在0.565%～0.609%之間，9—芴基甲氧基碳酰氯具有反應(yīng)迅速的特點(diǎn)，得出的產(chǎn)物也相對穩(wěn)定，但是無法將兩個異構(gòu)體明顯的區(qū)分開來，因此使用異硫氰酸苯酯代替原有衍生試劑，得出了更好的效果，通過采用間接（衍生化）檢測法對相關(guān)成分進(jìn)行分析可以得知，效果要比原有的衍生試劑要好。

2.2 直接檢測法

除芳香族氨基酸外，大多數(shù)氨基酸在近紫外區(qū)（200～400nm）無吸收，所以不能直接用紫外檢測器測定其含量，但三七素分子中含有草酰基團(tuán)，而草酸本身有紫外吸收，國內(nèi)有不少學(xué)者利用 HPLC在210nm左右的紫外區(qū)直接檢測生物樣品中草酸的含量。由此推測，在210nm附近檢測三七素應(yīng)源于其分子中的草酰基團(tuán)，在213nm紫外區(qū)用HPLC比較詳細(xì)地分析了三七不同組織中三七素的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)云南文山三七中三七素含量（以干重計(jì)）比其他產(chǎn)地高，含量范圍在0.42%～0.62%之間；花蕾?莖葉?根莖?主根?側(cè)根和須根的含量分別是0.86%?0.37%?0.88%?0.52%?0.41%和0.89%。利用離子對反相HPLC在220nm下分析了云南不同規(guī)格三七頭中的三七素含量（以干重計(jì)），范圍在0.561%～0.582%之間。在214nm下檢測并分離純化三七中的三七素。在213nm下利用HPLC法測定了三七片中的三七素含量，范圍在0.428%～0.435%之間。在213nm處檢測發(fā)現(xiàn)三七商品規(guī)格中“無數(shù)頭”的三七素含量最高，可達(dá)1.02%，而“13頭”至“120頭”中的含量在0.52%～0.69%之間。利用HPLC在213nm紫外檢測建立了三七頭和三七總皂苷提取廢液中三七素含量的分析方法。

2.3 流動注射檢測法（FIA）

流動注射分析法檢測三七素的原理是在恒流泵驅(qū)動的載體流中注射待測樣品，經(jīng)過反應(yīng)器時，三七素發(fā)生特異性的反應(yīng)，捕捉反應(yīng)物的光吸收信號實(shí)現(xiàn)對三七素的間接定量。首先用 FIA法通過谷氨酸氧化酶催化三七素氧化分解檢測山黧豆樣品中的三七素含量。谷氨酸氧化酶能低效率地分解三七素（催化活性僅僅是谷氨酸的0.8%），這主要是由于三七素與谷氨酸在分子結(jié)構(gòu)上比較相似（分子未端都有一個羧基）。谷氨酸氧化酶氧化分解谷氨酸和三七素時都能釋放出 H2O2，后者在過氧化物酶（通常使用辣根過氧化物酶）催化下氧化還原性染料使其變色。實(shí)際檢測時一般用兩個反應(yīng)器，第一個用谷氨酸氧化酶先破壞樣品中可能存在的大量谷氨酸，第二個反應(yīng)器中檢測谷氨酸氧化酶氧化分解三七素時釋放出的 H2O2。為提高檢測靈敏度，對該方法進(jìn)行了大量改進(jìn)，但至今仍未開發(fā)出能實(shí)際應(yīng)用的谷氨酸氧化酶傳感器。

3、討論

綜合上述的一些檢測方法可以得知，隨著時代的發(fā)展與進(jìn)步，相應(yīng)的檢測方法會更加完善，從最早的傳統(tǒng)檢測方法算起，三七素的檢測已經(jīng)經(jīng)歷了一段較長的時期，并且檢測的方法還會更加高效與節(jié)省時間。三七素是一種重要的三七藥效成分，探索三七素的生物活性甚為必要，本文介紹的三七素檢測方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。用HP LC直接檢測三七素，雖然操作相對簡單，但如果樣品成分復(fù)雜，尤其是樣品中如含有大量的草酸等有機(jī)酸時，則對三七素的分析會造成嚴(yán)重干擾。就現(xiàn)有技術(shù)水平，分析三七素在人體或動物體內(nèi)的動態(tài)變化，用定性和定量相結(jié)合的能定量和定性檢測的氣相色譜－質(zhì)譜或液相色譜－質(zhì)譜檢測法方法比較適宜。FIA法所用的儀器結(jié)構(gòu)極為簡單，自動化程度高，如果用特異性高的固定化酶電極作為檢測手段則完全可以替代色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)來快速準(zhǔn)確地測定三七素含量。目前，人們還未分離到植物特異性三七素分解酶。從綿羊瘤胃中分離到了形態(tài)不同的 3種球菌，它們都可以分解利用三七素。如果能從中分離出分解三七素的酶，進(jìn)一步開發(fā)出酶傳感器，則三七素的檢測會更加簡便。這種基于酶學(xué)的檢測方法或許是將來快速、準(zhǔn)確檢測三七素的一種趨勢。

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