張博筠 綜述，王中新 審校

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，合肥 230022)

·綜述·

光滑念珠菌三唑類藥物耐藥機制*

張博筠 綜述，王中新△審校

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，合肥 230022)

關(guān)鍵詞:光滑念珠菌；EGR11；ABC轉(zhuǎn)運蛋白；MDR

由于HIV感染、器官移植和腫瘤等免疫力減弱患者的增加和抗真菌藥物的不恰當使用，侵襲性真菌感染人數(shù)逐年增加，已經(jīng)對臨床各類疾病的治療造成巨大威脅。臨床標本中光滑念珠菌在非白色念珠菌中分離率最高。臨床分離出的所有假絲酵母菌中,光滑念珠菌三唑類耐藥率最高。我國約14.3%的光滑念珠菌對氟康唑耐藥；11.6%的氟康唑與伏立康唑交叉耐藥；2.3%的菌株對所有抗真菌藥物不敏感；沒有發(fā)現(xiàn)三唑類與棘白菌素交叉耐藥的菌株[1]。本文就光滑念珠菌三唑類耐藥機制綜述如下。

1形成生物被膜

使用植入性材料，如導(dǎo)管、中心靜脈插管大大增加了院內(nèi)感染的概率,且多引起耐藥微生物感染。大多數(shù)微生物是以生物被膜的形式黏附在其他物體表面。繼而定植、產(chǎn)生細胞外基質(zhì)、生物膜逐漸成熟和擴散。生物膜的形成有3個階段：(1)菌體黏附于表面支撐物，形成微菌落，微菌落融合并形成生物膜的基底層；(2)產(chǎn)生和釋放基質(zhì)；(3)形成三級致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，發(fā)育為成熟生物膜。人類65%的感染是生物被膜引起的。最近的研究證實，從生物膜中游離出的細胞比單個浮游酵母菌致死率更大[2]。多種因素參與生物膜耐藥：(1)pH，酸性環(huán)境中光滑念珠菌對三唑類敏感率更高[3]；(2)生物膜內(nèi)細胞密度高；(3)生物膜基質(zhì)對耐藥性的影響；(4)養(yǎng)分限制，膜內(nèi)細胞增長率低；(5)耐藥基因的表達，尤其是編碼外排泵的基因；(6)存在耐藥細胞株。對三唑類藥物而言，細胞密度對耐藥性影響很大。當細胞密度較低時(≤103/mL)，浮游酵母菌和生物膜內(nèi)酵母菌細胞對三唑類藥物都敏感，隨著細胞密度的增高，耐藥性也增高。在細胞密度較高的生物膜內(nèi)，細胞間通過“群體感應(yīng)”作用分泌信號分子，感知濃度變化從而檢測菌群密度、調(diào)控菌群生理功能，并且反饋性抑制菌群復(fù)制，使定植群落達到最適大小，以適應(yīng)周圍環(huán)境，形成成熟的生物膜。生物膜結(jié)構(gòu)是微生物為適應(yīng)生存環(huán)境而形成的與浮游細胞相對應(yīng)的存在方式，這種方式增強了自身防御系統(tǒng)，提高了其抗真菌藥物的耐藥性，導(dǎo)致藥物耐受性增加。血清可促進光滑念珠菌黏附于生物材料表面。血清中膽固醇可以促進AUS1表達，同時血清清蛋白與預(yù)后有關(guān)[4-5]。在侵襲性感染中，血清及組織液是體內(nèi)生物膜形成的基礎(chǔ)。生物膜的細胞外基質(zhì)可以通過離子交換、與帶電荷的抗菌藥物結(jié)合起來降低藥物的穿透力。單個細胞可以通過不可逆的基因突變產(chǎn)生耐藥表型，生物膜耐藥表型的產(chǎn)生依賴于自身的生理變化，而不依賴基因突變。對白色假絲酵母菌的試驗結(jié)果表明，在成熟生物膜內(nèi)的酵母菌對三唑類仍有耐藥性，但是比生物膜耐藥性弱。所以，在混合生物膜系統(tǒng)內(nèi)，細胞外基質(zhì)造成的藥物低滲透力并不是耐藥產(chǎn)生的唯一原因。生物膜形成能力與感染能力緊密相關(guān)，影響菌株毒力。一些學(xué)者用基因芯片技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析生物膜時發(fā)現(xiàn)了一些基因，如：過氧化物酶CTA1、酪氨酸生物合成及降解因子ARO、肌酸激酶MSK、熱休克蛋白90、神經(jīng)鞘脂類SKN1、KRE1、SIR、RIF、鋅調(diào)節(jié)基因ZAP1、細胞表面疏水性相關(guān)的CSH1、醇脫氫酶ADH5，它們在生物膜形成過程中起不同作用[6]。

2藥物外排作用增強

2.1ABC轉(zhuǎn)運蛋白是跨膜整合蛋白，存在于細胞膜或細胞器膜上，利用ATP 供能把藥物泵出細胞外，主要介導(dǎo)脂溶性物質(zhì)排出。有些ABC轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運特異性配體，有些轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)類似的一類蛋白，造成多藥物耐藥。它與易化擴散超載體家族(MFS)都是MDR蛋白。兩種蛋白都有特異性區(qū)域：核苷酸結(jié)合域(NBDs)和高度疏水跨膜域(TMDs)。ABC轉(zhuǎn)運蛋白由2個位于細胞質(zhì)的核苷酸結(jié)合域NBD和2個跨膜域TMD。NBDs與ATP結(jié)合并水解供能；TMDs 6次跨膜，形成單環(huán)。不同的ABC轉(zhuǎn)運蛋白NBDs和TMDs的空間位置不同。轉(zhuǎn)運藥物時，NBD以頭尾連接的方式結(jié)合2個ATP，每個ATP結(jié)合在NBD上的模體之間，ATP水解后，二聚體解離。對于外向運輸?shù)腁BC蛋白，當?shù)孜锝Y(jié)合位點在膜內(nèi)側(cè)時，蛋白質(zhì)與底物的親和力高，二者結(jié)合，構(gòu)象變化，底物結(jié)合位點暴露在細胞膜外，底物與結(jié)合位點的親和力降低，二者解離，釋放底物至細胞外。內(nèi)向運輸?shù)腁BC轉(zhuǎn)運蛋白機制復(fù)雜，當ATP供應(yīng)不足或者轉(zhuǎn)運蛋白表達減少時，酵母菌細胞對藥物攝入減少。CgCDR1是ABC轉(zhuǎn)運蛋白之一，其表達上調(diào)可以引起三唑類耐藥，敲除基因CgCDR1后，原耐藥株轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾兄?。yor1、Snq2、CgCDR16和CgPdh1(又作CgCdr2)突變也可引起耐藥[7]。不同轉(zhuǎn)運蛋白在耐藥性形成中地位不同[8]。CgCDR1的表達水平高于CgCDR2。敲除CgCDR2基因后光滑念珠菌對三唑類藥物敏感度未增加，同時敲除CgCDR1和CgCDR2時，光滑念珠菌敏感度上升50%。所以對于光滑念珠菌而言，CgCDR1突變的作用更顯著。

2.2PDR調(diào)節(jié)ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的生物合成，Snq2p、CgRTA1p和Pdr5p同屬于PDR亞族，它們與啟動子上游部位多向耐藥應(yīng)答片段(PDREs)作用，調(diào)節(jié)基因的表達。Pdr1、Pdr3p正向調(diào)節(jié)；與之染色體同源的STB5負向調(diào)節(jié)[9]。當敲除STB5時，PDR1的過量表達引起ABC轉(zhuǎn)運蛋白表達上調(diào)，光滑念珠菌耐藥性小幅度增強[10]。已發(fā)現(xiàn)PDR1的錯意突變位點57個，主要位于轉(zhuǎn)錄活化區(qū)、中間同源區(qū)和抑制區(qū)。P927S突變位于轉(zhuǎn)錄活化區(qū)，其突變株CgCDR1和CgCDR2基因表達上調(diào)，外排作用增強[11]。部分PDR1突變株毒力增強，造成耐藥[12]。PDR1突變可使另一種外排泵基因PUP1表達上調(diào)，同時PUP1基因也編碼線粒體蛋白[13]，所以PDR1突變與線粒體缺陷是否有共同途徑尚不清楚[14]。CgRTA1也參與正向調(diào)節(jié),它與PDREs的5′UTR區(qū)域結(jié)合，分別在含氟康唑培養(yǎng)基上同時培養(yǎng)敏感株與耐藥株，耐藥株CgRTA1的表達量在一定范圍內(nèi)隨氟康唑濃度升高而上升，敏感株CgRTA1表達沒有增加[15]。最近的研究顯示，PDR1點突變可造成黏附力增強,故PDR1還與菌株毒力有關(guān)[12,16]。國外有學(xué)者證實,呼吸抑制作用可以促進光滑念珠菌CgPDR1作用,CgCDR1表達上調(diào)[17]。

2.3MDR1基因編碼MFS。MFS是一種通過電化學(xué)勢能進行被動轉(zhuǎn)運的MDR蛋白，不依賴ATP供能，主要介導(dǎo)水溶性物質(zhì)泵出。MDR1基因過度表達可造成氟康唑耐藥。Mdr1P具有底物特異性，通過抑制藥物攝入，降低細胞內(nèi)藥物濃度造成耐藥，但是仍然有藥物不被抑制。

3Erg11基因突變與表達上調(diào)

Erg11基因編碼真菌14α-DM，該酶屬于細胞色素P-450家族，是三唑類藥物作用于真菌細胞的靶向酶，三唑類藥物與Erg11p結(jié)合，干擾真菌細胞膜麥角固醇的合成。麥角固醇合成過程復(fù)雜，參與合成的酶有Erg1-Erg27基因編碼，其中Erg11編碼的Erg11P是關(guān)鍵酶。三唑類藥物與之結(jié)合后，真菌細胞內(nèi)正常的麥角固醇逐漸耗竭，甲基化固醇在細胞內(nèi)聚集，從而改變了細胞膜成分，影響細胞膜穩(wěn)定性，抑制真菌生長，并最終導(dǎo)致細胞死亡。

Erg11基因突變改變了蛋白質(zhì)氨基酸序列，若改變發(fā)生在酶與唑類藥物的結(jié)合位點，則藥物的結(jié)合率降低，未結(jié)合的酶仍然可以參與正常的生化反應(yīng)，使麥角固醇合成量正常，有效降低藥物對細胞膜穩(wěn)定性的影響。國內(nèi)有研究擴增了光滑念珠菌耐藥株與敏感株Erg11基因，再將基因克隆至pUC57-T載體,利用此載體上通用引物進行基因測序，并與gene-bank上的基因進行比對,發(fā)現(xiàn)了10個突變位點,點突變包括轉(zhuǎn)換和顛換兩種形式[18]。5種突變在敏感株和耐藥株中均出現(xiàn)；兩種突變只在敏感株中出現(xiàn)；C2101G、C1073T、G1478A只在耐藥株中出現(xiàn)。Samaranayake等[19]對氟康唑耐藥菌株測序，未發(fā)現(xiàn)Erg11有意義突變。Erg11突變是否為光滑念珠菌耐藥產(chǎn)生的機制仍需試驗證明。

細胞內(nèi)Erg11P水平取決于其編碼基因的表達。當基因表達上調(diào)時，合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)物增多，而藥物濃度是定量的，過多的蛋白質(zhì)產(chǎn)物可以中和藥物，降低或抵消藥物對真菌細胞的藥理作用，維持真菌細胞膜的穩(wěn)定性，表現(xiàn)出對藥物的耐藥性。基于此，有試驗通過熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，分別測得光滑念珠菌三唑類藥物敏感株、藥物依賴性敏感株和耐藥株的mRNA水平，結(jié)果顯示3組真菌mRNA水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)[8]。Erg11基因表達上調(diào)可以造成光滑念珠菌對三唑類藥物耐藥。UPC2A調(diào)節(jié)Erg11基因轉(zhuǎn)錄，UPC2A突變株14α-DM合成減少，對氟康唑敏感度升高[20]；Erg11基因拷貝數(shù)增加，菌株耐藥性增強[21]。

光滑念珠菌合成麥角固醇需要鐵元素的參與。Aus1p是ATP轉(zhuǎn)運蛋白之一，向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運固醇。在缺鐵環(huán)境下，Aus1p向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運固醇增加，抵消了環(huán)境對細胞生長的抑制作用[22-23]。

4線粒體相關(guān)因素

線粒體功能障礙也是耐藥機制之一。線粒體內(nèi)基因缺失會使ABC轉(zhuǎn)運蛋白表達上調(diào)，但參與三唑類耐藥的具體機制仍未明確。

在Peng等[14]的試驗中，所有的耐藥菌株呼吸均受到抑制。氟康唑作用于光滑念珠菌時，耐藥株線粒體膜電位、活性氧水平ROS和細胞周期沒有發(fā)生變化；而敏感菌株線粒體內(nèi)膜電位隨藥物濃度升高而升高、ROS升高，呈劑量依賴關(guān)系。敏感菌株細胞周期多阻滯在G2/M期。細胞在G2/M期內(nèi)修復(fù)錯誤的DNA復(fù)制，在氟康唑長期作用下，細胞周期長期阻滯，DNA復(fù)制錯誤不斷累積，最終導(dǎo)致細胞凋亡。ROS的產(chǎn)生受線粒體膜電位控制，當細胞內(nèi)自由基水平增高時，過多的自由基與線粒體膜上的還原位點結(jié)合，導(dǎo)致線粒體氧化性損傷。ROS還能與A paf-1、caspase-9 前體、ATP/dATP 形成凋亡小體,通過級聯(lián)反應(yīng)引起細胞凋亡。同時,線粒體內(nèi)的錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)等清除氧自由基的能力下降,聚積更多的ROS,影響線粒體膜電位，造成線粒體膜電位崩潰,引發(fā)細胞凋亡。當細胞缺乏SODs時(Zn-SOD、Mn-SOD)，染色體自然突變率升高，呼吸缺陷株更容易突變?yōu)槟退幘闧24]。

線粒體基因的非缺失性突變造成線粒體功能的損害是可逆的，當暴露于氟康唑時，光滑念珠菌的線粒體可以在感受態(tài)和非感受態(tài)轉(zhuǎn)換，以此來逃避氟康唑的抑菌作用[25]。

綜上所述，多種機制共同參與光滑念珠菌對三唑類藥物的耐藥，臨床分離出的耐藥菌株可能有一種耐藥機制，也可能有多種。外排泵作用增強是造成耐藥的明確因素,Erg11基因突變、外排泵基因調(diào)控序列的突變及線粒體基因突變在光滑念珠菌對三唑類耐藥物中的作用仍需進一步探究。

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* 基金項目：安徽省高校省級自然科學(xué)研究資助項目(KJ2015A337)。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.027

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)11-1517-03

(收稿日期：2015-12-24修回日期：2016-02-21)

△通訊作者，E-mail:aywzhx87@163.com。