周立花，符免艾，李娟

(海南省農(nóng)墾總醫(yī)院生殖科，海南 海口 570311）

海南地區(qū)不孕人群HBV感染對(duì)體外受精-胚胎移植結(jié)局的影響

周立花，符免艾，李娟

(海南省農(nóng)墾總醫(yī)院生殖科，海南 海口 570311）

目的 了解海南地區(qū)不孕人群HBV的感染率，探討男方或女方HBV感染對(duì)體外受精-胚胎移植(IVF-ET)結(jié)局的影響。方法回顧性分析2009年1月至2014年12月在我院生殖科行IVF-ET助孕治療的1 192對(duì)夫婦共1 192個(gè)周期的資料，統(tǒng)計(jì)男性HBsAg(+)與女性HBsAg(+)例數(shù)，了解HBV的感染率。從1 192個(gè)周期中選取男性HBsAg(+)女性HBsAg(-)123個(gè)周期為男性HBV感染組、女性HBsAg(+)男性HBsAg(-)83個(gè)周期為女性HBV感染組，隨機(jī)選擇男女雙方均HBsAg(-)165個(gè)周期為對(duì)照組。分別比較男性HBV感染組、女性HBV感染組與對(duì)照組的精子質(zhì)量、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率和臨床妊娠率等各項(xiàng)指標(biāo)之間的差異性。結(jié)果1 192對(duì)夫婦個(gè)周期中HBV感染率為15.98%(381/2 384)。男性HBV感染組與對(duì)照組比較精子質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，2pn受精率低于對(duì)照組(56.8%vs 60.8%)，但移植日子宮內(nèi)膜厚度厚于對(duì)照組[(12.06±2.95)mm vs(11.06±2.29)mm]，臨床妊娠率高于對(duì)照組(41.5%vs 30.0%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。女性HBV感染組與對(duì)照組相比兩組的種植率[24.2%(66/204)vs 30.1%(45/150)]、臨床妊娠率(37.5%vs 30.0%)等指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論海南地區(qū)不孕人群HBV的感染率偏高，但無(wú)論是男方還是女方感染HBV均未影響IVF助孕結(jié)局。

海南地區(qū)；乙型肝炎；精子質(zhì)量；體外受精-胚胎移植

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個(gè)全球性的公共健康問(wèn)題。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界約20億人感染過(guò)乙肝病毒，其中約3.5億為慢性感染，而中國(guó)屬于HBV感染的高流行地區(qū)[1]。HBV雖然是嗜肝病毒，也可感染肝外其他組織，如女性的卵巢[2-3]和男性的睪丸、附睪中均能發(fā)現(xiàn)HBV-DNA[4]。因此，乙型肝炎病毒可能通過(guò)配子直接傳給后代，也有可能影響精子和卵子質(zhì)量，從而影響體外受精胚胎移植(IVF-ET)助孕結(jié)局。本文通過(guò)統(tǒng)計(jì)本院生殖科HBV的感染率，大致了解HBV感染在海南不孕人群中的發(fā)病率，并且通過(guò)與正常人群對(duì)比了解HBV感染是否影響體外受精胚胎移植助孕結(jié)局。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年1月至2014年12月在我院生殖科就診進(jìn)行IVF-ET治療的夫婦1 192對(duì)，共1 192個(gè)新鮮周期資料，男女雙方均行HBsAg檢測(cè)。選擇以長(zhǎng)方案或改良超長(zhǎng)方案促排卵的周期，并排除女方患多囊卵巢綜合征(PCOS)、子宮內(nèi)膜異位癥或夫婦雙方有支原體、衣原體感染。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)從1 192個(gè)周期中選取男性HBsAg(+)女性HBsAg(-)123個(gè)周期為男性HBV感染組、女性HBsAg(+)男性HBsAg(-)83個(gè)周期為女性HBV感染組，隨機(jī)選擇男女雙方均HBsAg(-)165個(gè)周期為對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 控制性超促排卵方案 (1)常規(guī)長(zhǎng)方案：上一次月經(jīng)黃體中期開始應(yīng)用長(zhǎng)效促性腺激素釋放激素類似物(達(dá)菲林)降調(diào)節(jié)。(2)改良超長(zhǎng)方案：在第一次降調(diào)同常規(guī)長(zhǎng)方案，28 d再次予長(zhǎng)效達(dá)菲林降調(diào)一次。達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)后[卵泡刺激素(FSH)≤5 mlU/mL，促黃體生成素(LH)≤5 mIU/mL，雌二醇≤50 pg/mL，內(nèi)膜≤5 mm，卵泡直徑≤5 mm]，應(yīng)用促性腺激素進(jìn)行促排卵。按B超檢測(cè)結(jié)果和血漿內(nèi)分泌激素水平調(diào)整促性腺激素(Gn)的用量。當(dāng)1個(gè)卵泡平均直徑＞18 mm、或3個(gè)卵泡平均直徑＞17 mm、或4個(gè)卵泡直徑＞16 mm時(shí)給予人絨毛膜促性腺激素(hCG)注射，36～37 h取卵。

1.2.2 精液處理 采用世界衛(wèi)生組織推薦的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)精液進(jìn)行精液常規(guī)分析及采用精子形態(tài)快速染色法，對(duì)精子染色后于顯微鏡下進(jìn)行嚴(yán)格的形態(tài)學(xué)檢查；采用密度梯度離心法進(jìn)行精液洗滌，并經(jīng)過(guò)上游處理。根據(jù)精子質(zhì)量、既往妊娠史，不孕年限等因素綜合考慮，選擇行IVF、IVF+ICSI或直接ICSI受精。

1.2.3 胚胎體外培養(yǎng) 胚胎卵裂期評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)取卵后胚胎形態(tài)和碎片多少，將胚胎分為4級(jí)。標(biāo)準(zhǔn)如下：Ⅰ級(jí)，細(xì)胞大小均勻，形態(tài)規(guī)則，透明帶完整，胞質(zhì)清晰，無(wú)顆?，F(xiàn)象，碎片＜5%卵裂球面積；Ⅱ級(jí)，細(xì)胞大小略不均，形態(tài)略不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象，碎片10%～20%；Ⅲ級(jí)，細(xì)胞大小明顯不均，可有明顯的形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象，碎片21%～50%；Ⅵ級(jí)，細(xì)胞大小嚴(yán)重不均，胞質(zhì)可有嚴(yán)重的顆?，F(xiàn)象，碎片＞50%。若胚胎發(fā)育速度過(guò)慢或過(guò)快，即第2天＜3個(gè)卵裂球或≥6細(xì)胞，第3天＜6細(xì)胞或≥10細(xì)胞，則卵裂期胚胎評(píng)分降級(jí)。我們將取卵后第3天卵裂球數(shù)目超過(guò)6和碎片小于20%的胚胎認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)胚胎[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩樣本計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HBV感染率 1 192個(gè)周期中男性HBsAg (+)223人，女性HBsAg(+)158人，夫婦雙方均HBsAg (+)68人(34對(duì))，HBV總感染率為15.98%[(223+158)/ 2 384)]。其中男性HBV感染率為18.71%(223/1 192)，女性為13.26%(158/1 192)。

2.2 男性HBV感染對(duì)IVF-ET影響 男性HBV感染組與對(duì)照組比較，雙方年齡，不孕年限、女方體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、原發(fā)或繼發(fā)不孕等因素比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，男方精液量、精子密度、前向運(yùn)動(dòng)精子比和正常精子比率兩組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，兩組Gn用量、獲卵數(shù)、受精方式、優(yōu)胚率、種植率比較差異也均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。對(duì)照組2pn受精率高于HBV感染組(56.8%vs 60.8%，P= 0.019)，但是男性HBV感染組移植日子宮內(nèi)膜厚度大于對(duì)照組[(12.06±2.95)mm vs(11.06±2.29)mm，P= 0.002)，臨床妊娠率高于對(duì)照組(41.5%vs 30.0%，P= 0.012)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

2.3 女性HBV感染對(duì)IVF-ET的影響 女性HBV感染組與對(duì)照組比較，雙方年齡，不孕年限、BMI，原發(fā)或繼發(fā)不孕等因素比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，男方精液量、精子密度、前向運(yùn)動(dòng)精子比和正常精子比率兩組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。兩組在Gn用量、獲卵數(shù)、受精方式、2pn受精率、優(yōu)胚率、種植率、移植日子宮內(nèi)膜厚度和臨床妊娠率等方面比較差異也均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表1 男性HBV感染組與對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)比較(±s)

表1 男性HBV感染組與對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)比較(±s)

基本情況女方年齡(歲)男方年齡(歲)不孕年限(年)原發(fā):繼發(fā)BMI精液量精子密度前向運(yùn)動(dòng)精子比精子正形率(%) Gn用量ET日內(nèi)膜厚度(mm)獲卵數(shù)2pn受精率(%)優(yōu)胚率(%)臨床妊娠率(%)種植率(%)受精方式IVF ICSI IVF+ICSI男方HBsAg(+) 33.09±4.67 35.89±5.25 5.49±3.59 42:81 21.22±2.43 2.24±0.82 77.32±53.03 48.21±17.65 8.06±4.77 2486.18±678.23 12.06±2.956 11.13±6.09 56.8 38.1 41.5(51/123) 32.4(66/204)對(duì)照組33.88±4.72 36.88±5.94 5.01±3.33 49:115 21.75±2.64 2.25±0.74 71.65±47.45 44.73±17.56 7.51±4.27 2486.74±649.11 11.06±2.29 11.42±6.10 60.8 35.0 30(45/150) 30.1(89/296) t值/χ2值-1.41 -1.48 1.161 0.645 -1.782 -0.109 0.952 1.659 0.974 -0.007 3.057 -0.405 5.495 1.97 6.386 0.295 2.093 P值0.160 0.140 0.247 0.422 0.085 0.914 0.342 0.098 0.331 0.994 0.002 0.686 0.019 0.160 0.012 0.587 0.351 62 35 23 76 43 43

表2 女性HBV感染組與對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)比較(±s)

表2 女性HBV感染組與對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)比較(±s)

基本情況 女方HBsAg(+)對(duì)照組女方年齡(歲)男方年齡(歲)不孕年限(年)原發(fā):繼發(fā)34.21±4.89 37.19±6.18 5.63±4.04 26:57 33.88±4.72 36.88±5.94 5.01±3.33 49:115 t值/χ2值P BMI精液量精子密度前向運(yùn)動(dòng)精子比精子正形率(%) Gn用量21.32±2.48 2.21±0.55 87.54±63.55 44.52±18.50 8.79±5.73 2490.66±753.11 21.75±2.64 2.25±0.74 71.65±47.45 44.73±17.56 7.51±4.27 2486.74±649.11 0.507 0.716 1.275 0.055 -1.232 -0.588 2.192 0.241 1.91 0.042 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0值ET日內(nèi)膜厚度(mm)獲卵數(shù)2pn受精率(%)優(yōu)胚率(%)臨床妊娠率(%)種植率(%)受精方式IVF ICSI IVF+ICSI 11.41±3.11 10.99±5.95 59(538/912) 38.1(190/538) 37.5(30/80) 24.2%(38/157) 11.06±2.29 11.42±6.10 60.8 35.0 30(45/150) 30.1%(89/296) 0.963 -0.536 0.885 0.020 1.335 1.748 2.332 .613 .716 .203 .815 .219 .557 .029 .810 .057 .966 0.337 0.592 0.347 0.887 0.248 0.186 0.312 44 24 15 76 43 43

3 討 論

在我院生殖科行IVF-ET助孕的夫婦需常規(guī)檢測(cè)是否有乙肝病毒攜帶，據(jù)我們的資料統(tǒng)計(jì)，IVF就診夫婦中HBV感染率為15.98%[(223+158)/2 384]，遠(yuǎn)高于我國(guó)1992年流行病學(xué)調(diào)查所顯示的1～59歲人群HBV感染率9.8%[6]。其中男性HBV感染率為18.7%(223/1 192)，也高于國(guó)內(nèi)其他學(xué)者所報(bào)道的ART中男性HBV的感染率，如費(fèi)前進(jìn)等[7]報(bào)道的1 208對(duì)ART夫婦中男方HBV感染率為13.9%，武新梅等[8]報(bào)道的溫州地區(qū)1 268對(duì)ART夫婦男方HBV感染率為15.1%。這可能與海南地區(qū)生活習(xí)慣、經(jīng)濟(jì)狀況和人口流動(dòng)較大相關(guān)。

通過(guò)檢查HBV感染男性患者的睪丸和附睪組織，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞和支持細(xì)胞均能檢測(cè)到HBV-DNA[4]。用HBV感染精子行人精子去透明帶金黃地鼠卵穿透試驗(yàn)獲得精子染色體，發(fā)現(xiàn)染色體異常顯著增加，而且還表現(xiàn)出僵硬、轉(zhuǎn)曲和不易上色的特點(diǎn)[9]。因此推測(cè)HBV感染除了可能將HBV病毒通過(guò)精子直接傳染給后代外，還能影響精子質(zhì)量。但是我們通過(guò)對(duì)比男性HBV感染組與對(duì)照組的精液量，精子密度、前向精子比率和正常精子比率，兩組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這個(gè)結(jié)果不同于有些研究者的報(bào)道，他們的研究結(jié)果顯示HBV感染會(huì)使精子的密度減少、活力偏低和畸形率升高[10-11]。HBV導(dǎo)致精子質(zhì)量異常的可能機(jī)制是：乙肝病毒作用于精子前的各級(jí)生精細(xì)胞，導(dǎo)致生精細(xì)胞調(diào)亡的增加，可誘導(dǎo)精子凋亡通路中的早期變化的發(fā)生，導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性受損和通透性增加[12]。還可以整合到精子DNA，導(dǎo)致精子染色體的不穩(wěn)定，誘導(dǎo)基因突變，造成精子DNA損傷和染色體異常[13]。

隨著不孕不育人群的增多，乙肝患者夫婦求助輔助生殖技術(shù)的人數(shù)也在不斷的增加。但HBV感染對(duì)是否對(duì)輔助生殖技術(shù)助孕結(jié)果有影響，目前存在很大的爭(zhēng)議。HBV可以進(jìn)入男性精子，整合進(jìn)入人的基因組[14]。攜帶有乙肝病毒的精子可以穿過(guò)透明帶，進(jìn)入卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，受精后，在胚胎的早卵裂期就表達(dá)HBV的mRNA和蛋白[15]。HBV感染的女性在卵子和胚胎中也能檢測(cè)出HBV-DNA[16-17]。研究報(bào)道HBV的感染會(huì)降低IVF/ICSI的受精率、胚胎種植率和妊娠率[18-19]，并會(huì)提高妊娠早期流產(chǎn)率[20-21]，甚至還有報(bào)道認(rèn)為女性HBV感染與分娩時(shí)孕周相關(guān)[22]。相反，Lee等[23]發(fā)現(xiàn)盡管男性HBV陽(yáng)性患者的精子正常形態(tài)率顯著降低，但行IVF治療的臨床種植率和妊娠率無(wú)顯著降低，用HBV感染的男性精子與供卵結(jié)合后，與對(duì)照組比較，受精率和臨床妊娠率也差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[24]。還有研究認(rèn)為HBV感染組有更高的種植率(43.3%vs 18.4%，P＜0.01)和繼續(xù)妊娠率(53.3%vs 24.2%，P＜0.01)[21]。本研究中，男性HBV感染組精子質(zhì)量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明HBV感染未影響到精子質(zhì)量。雖然男性HBV感染組2pn受精率低于對(duì)照組，但妊娠率高于對(duì)照組(41.5%vs 30.0%，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與移植日子宮內(nèi)膜厚度大于對(duì)照組有關(guān)(12.06±2.95 vs 11.06±2.29)，而是否與乙肝感染關(guān)系不明確。我們的研究能證明男性HBV感染不會(huì)降低IVF-ET的臨床妊娠率。而女性乙肝組的2pn受精率，種植率和妊娠率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然目前有很多關(guān)于HBV感染對(duì)輔助生殖技術(shù)結(jié)局影響的研究報(bào)道，但是是否有影響仍有爭(zhēng)議，影響的機(jī)制仍不明確。由于樣本量和研究人群的不同，HBV感染程度不同，以及精子和卵子和胚胎的修復(fù)作用，各個(gè)研究者給予的結(jié)論也不完全相同。

我們研究顯示，海南地區(qū)不孕人群HBV感染率偏高。無(wú)論男方還是女方HBV感染，均未影響體外受精輔助生殖技術(shù)的結(jié)局，HBV感染的患者同正常人群一樣，可以通過(guò)輔助生殖技術(shù)幫助解決生育問(wèn)題。

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Impact of HBV infection on the outcomes of in vitro fertilization and embryo transfer in Hainnan province.

ZHOU Li-hua,FU Mian-ai,LI Juan.Department of Reproduction,Hainan Provincial Nongken General Hospital,Haikou 570311, Hainan,CHINA

ObjectiveTo examine the prevalence of hepatitis B virus(HBV)infection in the infertile couples in Hainan province,and to analyze the effect of HBV infection on the outcomes of in vitro fertilization and embryo transfer(IVF-ET).MethodsA retrospective analysis was performed on 1 192 couples receiving IVF-ET(1 192 cycles) form January 2009 to December 2014 in Hainan Provincial Nongken General Hospital.The number of males and females with HBsAg(+)was recorded,and the prevalence of HBV infection was examined.One hundred and twenty-three cycles of male HBsAg(+)and female HBsAg(-)were selected as male HBV infected group,and 83 cycles of female HBsAg(+)and male HBsAg(-)were selected as female HBV infected group,with 165 cycles of male HBsAg(-)and female HBsAg(-)as the control group.Sperm quality,fertilization rate,high-quality embryo rate,implantation rate,and clinical pregnancy rate were compared between male HBV infected group and control group,female HBV infected group and control group.ResultsThe HBV infection rate was 15.98%(381/2 384)in the 1 192 couples.Male HBV infected group and control group had no statistically significant difference in sperm quality(P＞0.05),but the two groups showed statistically significant difference in 2pn fertilization rate(56.8%vs 60.8%),endometrial thickness on the day ofembryos transferred[(12.01±2.95)mm vs(11.06±2.29)mm],and the clinical pregnancy rate(41.5%vs 30.0%),P＜0.05. Female HBV infected group and the control group showed no statistically significant difference in implantation rate [24.2%(66/204)vs 30.1%(45/150)]and clinical pregnancy rate(37.5%vs 30.0%),P＞0.05.ConclusionThe HBV infection rate of the infertile patients was relatively high in Hainan province,but neither the man nor the woman infected with HBV exerted any effect on the outcomes of IVF-ET.

Hainan province;Hepatitis B;Sperm quality;In vitro fertilization and embryo transfer(IVF-ET)

R512.6+2

A

1003—6350（2016）07—1044—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.07.005

2015-11-02)

海南省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目（編號(hào)：13A200036）

李娟。E-mail：hainanjuanli@163.com