潘麗英，黃福海，鐘雪花

(1.深圳市寶安區(qū)沙井人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 深圳 518125；2.深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518106；3深圳市寶安區(qū)沙井人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518125)

Galectin-9對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

潘麗英1，黃福海2，鐘雪花3

(1.深圳市寶安區(qū)沙井人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 深圳 518125；2.深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518106；3深圳市寶安區(qū)沙井人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518125)

目的探討半乳糖凝集素-9(Galectin-9)對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。方法將不同濃度外源性Galectin-9[0(陰性對(duì)照)、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL]加入卵巢癌SKOV3細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h，Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)Galectin-9的表達(dá)，MTT法檢測細(xì)胞活力，Transwell法檢測細(xì)胞遷移及侵襲能力，Western blot檢測基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、MMP9、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白E-鈣粘蛋白(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)。結(jié)果與陰性對(duì)照比較，4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL外源性Galectin-9能顯著提高卵巢癌SKOV3細(xì)胞中Galectin-9的表達(dá)(P＜0.01)；4 μg/mL、8 μg/ml、16 μg/mL外源性Galectin-9能顯著降低SKOV3細(xì)胞活力[(100.00± 7.46)vs(77.92±8.03)、(60.62±6.42)、(47.63±5.41)](P＜0.01)，減少細(xì)胞遷移[(99.49±9.63)vs(78.36±8.90)、(65.42±7.32)、(50.31±6.78)]及侵襲數(shù)目[(99.13±10.30)vs(76.69±7.23)、(63.68±6.32)、(52.37±4.99)](P＜0.01)，并能顯著下調(diào)MMP2、MMP9及Vimentin的表達(dá)(P＜0.01)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)(P＜0.01)。結(jié)論上調(diào)卵巢癌細(xì)胞SKOV3中Galectin-9的表達(dá)能顯著抑制細(xì)胞遷移侵襲等惡性生物學(xué)行為，可能與下調(diào)MMPs及調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

半乳糖凝集素-9；卵巢癌細(xì)胞SKOV3；侵襲；轉(zhuǎn)移

卵巢癌是女性生殖器官惡性腫瘤之一，其死亡率居?jì)D科惡性腫瘤首位。作為一種嚴(yán)重威脅女性健康和生命的惡性腫瘤，卵巢癌具有發(fā)現(xiàn)晚、轉(zhuǎn)移早、進(jìn)展快及預(yù)后差的特點(diǎn)。而導(dǎo)致卵巢癌死亡率居高不下的主要原因是腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[1-2]。半乳糖凝集素-9(Galectin-9)是半乳糖結(jié)合蛋白家族的成員之一，能特異性結(jié)合于細(xì)胞表面和細(xì)胞間質(zhì)中的半乳糖，從而發(fā)揮細(xì)胞間及細(xì)胞與間質(zhì)間的信號(hào)傳遞作用。研究證實(shí)Galectin-9與自身免疫性疾病、炎癥、生殖及腫瘤等多種疾病密切相關(guān)[3]。此外大量研究報(bào)道證實(shí)Galectin-9在食管鱗狀細(xì)胞癌，乳腺癌、結(jié)直腸癌，胃癌，口腔鱗癌，膠質(zhì)瘤及肝癌中低表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生，進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[4]。本課題組前期研究也證實(shí)Galectin-9在卵巢癌組織、癌旁組織，卵巢良性組織中表達(dá)逐漸降低，且Galectin-9與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示Galectin-9與卵巢癌的發(fā)生，進(jìn)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能成為卵巢癌預(yù)后的標(biāo)志及基因治療的靶點(diǎn)。因此，本研究在此基礎(chǔ)上，探討外源性Galectin-9對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移影響的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 卵巢癌細(xì)胞SKOV3購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，目錄號(hào)TCHu185；兔抗MMP2、MMP9、E-cadherin、Vimentin、GADPH單克隆抗體(Epitmics公司)；兔抗Galectin-9多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；重組人Galectin-9(美國R&D公司)；胎牛血清，DMEM養(yǎng)基(Hyclone公司)；Transwell小室(Corning公司)。迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠)；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；

1.2 方法

1.2.1 MTT法 將卵巢癌細(xì)胞SKOV3接種于96孔板培養(yǎng)24 h后，將不同濃度外源性Galectin-9[0(陰性對(duì)照)、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL]加入細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h，加入20 μL的5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μL DMSO，震蕩使結(jié)晶物充分溶解，于酶標(biāo)儀560 nm處測OD值，細(xì)胞相對(duì)活力(%)=(Galectin-9組OD值)/(陰性對(duì)照OD值)×100%。

1.2.2 遷移實(shí)驗(yàn) 將卵巢癌細(xì)胞SKOV3接種于6孔板培養(yǎng)24 h后，將不同濃度外源性Galectin-9[0 (陰性對(duì)照)、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL]加入細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h，細(xì)胞消化加入Transwell上室，下室用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，洗滌，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，倒置光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算平均每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，即表示細(xì)胞的侵襲能力。

1.2.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel膠均勻平鋪于Transwell小室的微膜(5 μm)上，制成凝膠備用。按1.2.2進(jìn)行操作，最后倒置光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算平均每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，即表示細(xì)胞的侵襲能力。

1.2.4 Western blot將卵巢癌細(xì)胞SKOV3接種于6孔板培養(yǎng)24 h后，將不同濃度外源性Galectin-9[0 (陰性對(duì)照)、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL]加入卵巢癌SKOV3細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h，消化收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液，每隔10 min置于渦旋儀中震蕩30 s，40 min后，離心，小心吸取上清，即可獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測定。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，后濕法轉(zhuǎn)膜。將膜浸入一抗溶液孵育，4℃過夜；漂洗后，浸入二抗溶液中室溫孵育1～2 h。將膜取出漂洗，在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件對(duì)各抗體條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外源性Galectin-9對(duì)SKOV3細(xì)胞中Galectin-9表達(dá)量的影響 如圖1所示，通過Western blot證實(shí)，4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL Galectin-9能顯著提高卵巢癌細(xì)胞中Galectin-9的表達(dá)量(P＜0.01)。

圖1 外源性Galectin-9對(duì)SKOV3細(xì)胞中Galectin-9表達(dá)量的影響

2.2 外源性Galectin-9對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3生物學(xué)行為的影響 如表1所示，4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml的Galectin-9能顯著的抑制SKOV3細(xì)胞活力，減少細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)目，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。如表2所示，4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml Galectin-9能顯著下調(diào)SKOV3細(xì)胞中MMP2、MMP9及Vimentin的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 外源性Galectin-9對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3生物學(xué)行為的影響(±s)

表1 外源性Galectin-9對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3生物學(xué)行為的影響(±s)

注：與陰性對(duì)照比較，aP＜0.01。

組別 相對(duì)細(xì)胞活力(%)細(xì)胞遷移數(shù)目 細(xì)胞侵襲數(shù)目陰性對(duì)照4 μg/mL Galectin-9 8 μg/mL Galectin-9 16 μg/mLGalectin-9 100.00±7.46 77.92±8.03a60.62±6.42a47.63±5.41a99.49±9.63 78.36±8.90a65.42±7.32a50.31±6.78a99.13±10.30 76.69±7.23a63.68±6.32a52.37±4.99a

表2 外源性Galectin-9對(duì)SKOV3細(xì)胞中MMPs、E-cadherin及Vimentin表達(dá)量的影響(±s)

表2 外源性Galectin-9對(duì)SKOV3細(xì)胞中MMPs、E-cadherin及Vimentin表達(dá)量的影響(±s)

注：與陰性對(duì)照比較，aP＜0.01。

組別陰性對(duì)照4 μg/mL Galectin-9 8 μg/mL Galectin-9 16 μg/mL Galectin-9 Vimentin/GADPH 1.12±0.11 0.84±0.08a0.64±0.06a0.44±0.05aMMP2/GADPH 1.35±0.13 1.10±0.104a0.78±0.08a0.53±0.04aMMP9/GADPH 1.01±0.10 0.83±0.05a0.73±0.06a0.41±0.04aE-cadherin/GADPH 0.20±0.02 0.31±0.02a0.64±0.04a1.00±0.11a

3 討 論

侵襲轉(zhuǎn)移是卵巢癌患者死亡的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多步驟、復(fù)雜的過程，其包括細(xì)胞外基質(zhì)的降解，粘附的降低，穿過血管內(nèi)滲至微循環(huán)，后經(jīng)微循環(huán)系統(tǒng)穿過血管，外滲至組織，最終轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處形成新的轉(zhuǎn)移灶。因此細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的必要步驟，MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)的最重要的蛋白水解酶，在細(xì)胞腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。MMP2不僅可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的明膠Ⅳ型膠原等，有利于腫瘤細(xì)胞沿著受損的基底膜向周圍浸潤，還可以通過新生毛細(xì)血管促進(jìn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。MMP9是由多種細(xì)胞分泌的一種蛋白水解酶，是MMPs中分子量最大的酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，從而增加細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，促進(jìn)腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。申麗媛等[5]證實(shí)MMP2及MMP9在卵巢癌組織中的表達(dá)均高于正常卵巢組織及卵巢良性組織，并與卵巢癌的臨床分期有關(guān)，提示MMP2及MMP9對(duì)卵巢癌病情演變和預(yù)后評(píng)估具有重要意義。因此下調(diào)MMP2及MMP9的表達(dá)能一定程度上抑制卵巢癌的進(jìn)展及侵襲行為。EMT是轉(zhuǎn)移發(fā)生的第一步，最早在胚胎發(fā)育過程中得到證實(shí)，EMT可誘導(dǎo)原發(fā)部位的腫瘤擴(kuò)散，使得腫瘤侵犯周圍組織，并通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處形成新的轉(zhuǎn)移灶，是卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要分子機(jī)制。EMT的分子標(biāo)志性特征為細(xì)胞間黏附分子E-cadherin消失，一系列間充質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)增加，包括波形蛋白(Vimentin)和纖連蛋白[6-7]。E-cadherin表達(dá)減少，有利于腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落，促進(jìn)腫瘤浸潤擴(kuò)散。Vimentin高表達(dá)可以減弱E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間的黏附，從而促進(jìn)細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移。E-cadherin在卵巢癌組織中低表達(dá)，Vimentin在卵巢癌組織中高表達(dá)，并與卵巢癌組織臨床分期，組織學(xué)分級(jí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過阻斷EMT的發(fā)生，能降低患病的風(fēng)險(xiǎn)[8]。因此逆轉(zhuǎn)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，能抑制癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

Galectin-9是半乳糖結(jié)合蛋白家族的成員之一，屬于動(dòng)物凝集素，能夠與細(xì)胞表面和細(xì)胞間質(zhì)中的半乳糖特異性的結(jié)合，發(fā)揮細(xì)胞間以及細(xì)胞與間質(zhì)間的信號(hào)傳遞作用。Galectin-9參與了機(jī)體許多生理和病理過程，包括細(xì)胞間黏附、細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)等。Galectin-9廣泛分布于人體多數(shù)組織，包括腦、乳腺、胃、肝臟、胰島細(xì)胞、肺臟、子宮、扁桃體和多種免疫細(xì)胞。已報(bào)道Galectin-9在食管鱗狀細(xì)胞癌，乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、口腔鱗癌、膠質(zhì)瘤及肝癌中低表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[4]。Chan等[9]證實(shí)Galectin-9在口腔鱗癌中低表達(dá)，并在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的陽性表達(dá)低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Zhang等[10]證實(shí)肝細(xì)胞癌中Galectin-9的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，血管侵襲及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且陽性表達(dá)Galectin-9的肝細(xì)胞癌患者有更長的生存時(shí)間。以上的報(bào)道說明了Galectin-9的表達(dá)與腫瘤的結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本課題先前研究也證實(shí)Galectin-9與卵巢癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究在此基礎(chǔ)上探討了外源性Galectin-9對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，結(jié)果表明，4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml Galectin-9能顯著的抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3的遷移侵襲能力，并下調(diào)MMP2、MMP9及Vimentin的表達(dá)，上調(diào) E-cadherin的表達(dá)。Nobumoto等[11]證實(shí)將Galectin-9靜脈注射到高轉(zhuǎn)移性B16F10膠質(zhì)瘤細(xì)胞及Colon26結(jié)腸癌細(xì)胞小鼠模型中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤小鼠中肺轉(zhuǎn)移受到抑制，粘附分子的表達(dá)上升，從而抑制腫瘤細(xì)胞粘附到血管內(nèi)皮及細(xì)胞外基質(zhì)。從而提示外源性Galectin-9能顯著抑制卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移，與調(diào)節(jié)MMPs及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

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Effect of Galectin-9 on invasion and metastasis of ovarian cancer cells SKOV3.

PAN Li-ying1,HUANG Fu-hai2, ZHONG Xue-hua3.1.Department of Gynaecology and Obstetrics,Shajing People's Hospital of Baoan District of Shenzhen, Shenzhen 518125,Guangdong,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,People's Hospital of Guangming New District of Shenzhen,Shenzhen 518106,Guangdong,CHINA;3.Department of Clinical Medicine,Shajing People's Hospital of Baoan District of Shenzhen,Shenzhen 518125,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore effect of Galactose lectin-9(Galectin-9)on invasion and metastasis in ovarian cancer cells SKOV3.MethodsSKOV3 cells were treated with different concentrations of exogenous Galectin-9[0(negative control),4 μg/mL,8 μg/mL,16 μg/mL]for 48 h.The expression of Galectin-9 in SKOV3 cells was detected by Western blot.Cell viability was measured by MTT assay,and the ability of cell migration and invasion was detected by transwell assay.The expression of matrix metalloproteinase 2(MMP2),MMP9,EMT related proteins E-cadherin and Vimentin was detected by Western blot.ResultsCompared with negative control,4 μg/mL,8 μg/mL,16 μg/mL Galectin-9 upregulated the expression of Galectin-9 in SKOV3 cells(P＜0.01),and inhibited SKOV3 cells viability[(100.00±7.46)vs (77.92±8.03),(60.62±6.42),(47.63±5.41),P＜0.01],migration[(99.49±9.63)vs(78.36±8.90),(65.42±7.32),(50.31±6.78), P＜0.01]and invasion[(99.13±10.30)vs(76.69±7.23),(63.68±6.32),(52.37±4.99),P＜0.01],as well as down-regulated the expression of MMP2,MMP9 and Vimentin(P＜0.01)and upregulated the expression of E-cadherin(P＜0.01).ConclusionOverexpresion of Galectin-9 in SKOV3 cell could inhibit cell migration,invasion and metastasis,which is associated with down-regulation of the expression of MMPs and regulation of the expression of EMT related proteins.

Galactose lectin-9;Ovarian cancer cells SKOV3;Invasion;Metastasis

R737.31

A

1003—6350（2016）07—1039—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.07.003

2015-10-30)

廣東省深圳寶安區(qū)科技計(jì)劃社會(huì)公益項(xiàng)目(編號(hào)：2015230)

潘麗英。E-mail：panliying630@126.com