陳博，謝琳

(廣東醫(yī)學(xué)院東莞校區(qū)生理科學(xué)實(shí)驗(yàn)室1、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2，廣東 東莞 523808)

蛙血清小分子肽對大鼠腦缺血再灌注細(xì)胞凋亡的影響

陳博1，謝琳2

(廣東醫(yī)學(xué)院東莞校區(qū)生理科學(xué)實(shí)驗(yàn)室1、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2，廣東 東莞 523808)

目的 探討蛙血清小分子肽對大鼠腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的作用，分析其可能的作用機(jī)制。方法將雄性SD大鼠100只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和蛙血清小分子肽高(90 mg/kg)、中(30 mg/kg)、低(10 mg/kg)劑量組，每組20只。采用改良線栓法栓塞大鼠大腦中動脈建立大鼠缺血再灌注損傷模型，缺血2 h再灌注24 h，進(jìn)行神經(jīng)行為評分，后處死；采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡；采用免疫組化法檢測B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl相關(guān)x蛋白(Bax)、細(xì)胞色素c(Cytc)、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3(Caspase-3)的表達(dá)情況。結(jié)果在神經(jīng)行為評分上，假手術(shù)組為(0.00±0.00)分，模型組為(2.38±0.78)分，小分子肽高劑量組為(1.47±0.41)分，中劑量組為(1.68±0.52)分，低劑量組為(2.01±0.66)分，小分子肽高、中劑量組與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；在凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)上，假手術(shù)組為(3.37±1.10)個，模型組為(42.80±3.54)個，小分子肽高劑量組為(28.00±2.28)個，中劑量組為(32.40±3.26)個，低劑量組為(41.40±1.20)個，小分子肽高、中劑量組與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；在凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cytc、Caspase-3和Bcl-2表達(dá)上(個/高倍視野)，假手術(shù)組分別為(3.01±1.12)、(2.58±1.74)、(2.34±1.37)、(65.42±3.65)，模型組分別為(70.67±3.06)、(58.31±5.04)、(68.04±5.85)、(31.26±2.81)，小分子肽高劑量組分別為(40.56±4.52)、(33.65±3.44)、(41.56±4.52)、(55.64±5.49)，中劑量組分別為(47.29±5.04)、(38.09±4.24)、(47.29±5.04)、(48.33±4.26)，低劑量組分別為(53.20±4.70)、(44.53±4.39)、(53.20±4.70)、(40.35±3.17)，小分子肽高、中、低劑量組均能抑制Bax、Cytc、Caspase-3蛋白表達(dá)，增加Bcl-2蛋白表達(dá)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，以高劑量組效果最優(yōu)，且存在量效依賴關(guān)系。結(jié)論蛙血清小分子肽是通過增強(qiáng)Bcl-2蛋白表達(dá)和抑制Bax、Cytc、Caspase-3蛋白表達(dá)來減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)目，改善神經(jīng)功能癥狀，保護(hù)腦缺血再灌注損傷。

大鼠；蛙血清；小分子肽；腦缺血再灌注；細(xì)胞凋亡；作用機(jī)制

現(xiàn)代研究表明，在動物血清去蛋白提取物如小牛血清去蛋白注射液中，具有藥理作用的是小分子肽[1]。筆者一直致力于蛙血清方面的研究，通過前期研究已經(jīng)證實(shí)了蛙血清去蛋白提取物中含有對心、腦缺血缺氧性損傷有保護(hù)作用的小分子肽類物質(zhì)，也分離出了一種分子量為1 638 Da的高純度的小分子肽，本研究將從細(xì)胞凋亡方面來探討這種小分子肽保護(hù)腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量220～250 g，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013-0008，使用許可證號：SYXK(粵)2013-0007。

1.2 藥品試劑 蛙血清小分子肽(本實(shí)驗(yàn)室提純)；Anti-Bax Rabbit polyclonal、Anti-Bcl-2 Rabbit polyclonal、Anti-Cytochrome C Rabbit polyclonal、Anti-Caspase-3 Rabbit polyclonal、Anti-Actin Rabbit polyclonal (均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；TUNEL試劑盒(德國默克公司)；DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 動物分組 將100只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為五組：假手術(shù)組、模型組和小分子肽高劑量(90 mg/kg)、中劑量(30 mg/kg)、低劑量(10 mg/kg)組，每組20只。腹腔注射給藥，假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水。從術(shù)前3 d開始，每天1次，造模當(dāng)天于手術(shù)前1 h給藥，再灌注后1 h給藥1次。

1.4 大鼠腦缺血再灌注模型制備[2]將大鼠麻醉固定，做頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎右側(cè)頸總動脈及頸外動脈根部，用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈遠(yuǎn)心端，由頸總動脈近分叉處剪一小口，插入頭端光滑尼龍魚線(直徑0.23 mm)，打一松結(jié)防止血液反流，尼龍魚線插入長度約(18±0.5)mm，實(shí)現(xiàn)大腦中動脈阻塞導(dǎo)致腦缺血，結(jié)扎并固定線栓，逐層縫合肌肉和皮膚。2 h后回抽線栓，實(shí)現(xiàn)大腦中動脈再灌注。假手術(shù)組僅分離血管不插線栓，其余各組均按上述手術(shù)步驟進(jìn)行。大鼠清醒后立即觀察其行為障礙程度，以Longa等[3]的5分法為評分標(biāo)準(zhǔn)：0分無神經(jīng)缺損癥狀；1分為提尾時癱側(cè)前肢內(nèi)收，不能全伸直；2分為向癱側(cè)作轉(zhuǎn)圈運(yùn)動；3分為行走時向癱側(cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。分值越高，表示大腦功能障礙程度越嚴(yán)重。

1.5 檢測指標(biāo) 腦缺血再灌注24 h后，麻醉固定，開胸暴露心臟，從心尖處插入灌注針至左心室，并剪開右心耳，從左心室快速灌注肝素生理鹽水至清澈，后用4%多聚甲醛灌注固定。迅速取腦置于4%多聚甲醛中固定24 h以上，固定和石蠟包埋，切片，厚度5 μm。按TUNEL試劑盒說明進(jìn)行操作[4]，觀察腦組織凋亡情況。用免疫組化法檢測Bax、Bcl-2、Cytc、Caspase-3蛋白的表達(dá)情況。每個腦組織標(biāo)本選取5張切片光學(xué)顯微鏡400倍觀察并進(jìn)行圖像分析，由軟件數(shù)出每張照片中陽性細(xì)胞的數(shù)量。胞核或胞漿有棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05，方差分析有顯著性時，用LSD法進(jìn)行兩兩比較，均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)行為評分比較 模型組大鼠全部出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，出現(xiàn)左前肢屈曲，肌張力降低，向左側(cè)追尾轉(zhuǎn)圈，右側(cè)Horner征等癥狀。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，假手術(shù)組沒有出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙。與模型組比較，小分子肽高、中劑量組神經(jīng)損傷程度明顯改善，神經(jīng)行為評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示小分子肽能夠改善腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能癥狀，高劑量效果更優(yōu)，且存在量效依賴關(guān)系(見表1)。

表1 各組大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)行為評分(±s)

表1 各組大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)行為評分(±s)

組別假手術(shù)組模型組高劑量組中劑量組低劑量組F值P值例數(shù)20 20 20 20 20劑量(mg/kg) --9 0 30 10神經(jīng)行為評分0.00±0.00 2.38±0.78 1.47±0.41a1.68±0.52a2.01±0.66 11.54 0.000

2.2 小分子肽對細(xì)胞凋亡的影響 光鏡下，細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為凋亡細(xì)胞，TUNEL染色陽性表現(xiàn)。表2顯示，假手術(shù)組腦組織切片細(xì)胞形態(tài)完整，基本未見TUNEL陽性細(xì)胞。模型組可見大量TUNEL陽性細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。小分子肽處理后，高、中劑量組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于模型組(P＜0.05)；低劑量組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示高、中劑量小分子肽能夠抑制腦缺血再灌注損傷后的腦細(xì)胞凋亡，高劑量效果更顯著，且存在量效依賴關(guān)系。

組別假手術(shù)組模型組高劑量組中劑量組低劑量組F值P值例數(shù)20 20 20 20 20劑量(mg/kg) --9 0 30 10 TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)(個/高倍視野) 3.37±1.10 42.80±3.54a28.00±2.28b32.40±3.26b41.40±1.20 8.47 0.000注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

2.3 小分子肽對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 Bax、Cytc、Caspase-3表達(dá)的陽性細(xì)胞呈棕黃色顆粒。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組的Bax、Cytc、Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增多(P＜0.05)；與模型組比較，小分子肽高、中、低劑量組Bax、Cytc、Caspase-3蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低(P＜0.05)。Bcl-2蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞細(xì)胞漿染成棕黃色。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組Bcl-2表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)；與模型組比較，小分子肽高、中、低劑量組均顯著增加Bcl-2表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)(P＜0.05)，說明小分子肽有抗細(xì)胞凋亡作用。綜上，腦缺血再灌注損傷后Bax、Cytc、Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)增加，Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)降低，表明小分子肽能抑制促凋亡蛋白Bax、Cytc、Caspase-3的表達(dá)，增強(qiáng)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，高劑量效果更顯著，且存在量效依賴關(guān)系，見表3。

表3 小分子肽對細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Cytc、Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)的影響(個/高倍視野，±s)

表3 小分子肽對細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Cytc、Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)的影響(個/高倍視野，±s)

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別 例數(shù) 劑量(mg/kg) Bax Bcl-2Cytc Caspase-3假手術(shù)組模型組高劑量組中劑量組低劑量組F值P值20 20 20 20 20 --9 0 30 10 3.01±1.12 70.67±3.06a40.56±4.52b47.29±5.04b53.20±4.70b21.83 0.000 65.42±3.65 31.26±2.81a55.64±5.49b48.33±4.26b40.35±3.17b17.64 0.000 2.58±1.74 58.31±5.04a33.65±3.44b38.09±4.24b44.53±4.39b19.48 0.000 2.34±1.37 68.04±5.85a41.56±4.52b47.29±5.04b53.20±4.70b23.52 0.000

3 討 論

小分子肽具有特殊的生物學(xué)功能，部分小分子肽已經(jīng)在抗腫瘤、抗病毒、抗菌等方面取得了很大的研究進(jìn)展，近年來也有很多研究表明小分子肽對缺血缺氧腦損傷有保護(hù)作用[5]。筆者對蛙血清進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)蛙血清去蛋白提取物能提高心、腦組織對缺氧的耐受力[6]，對大鼠腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用[7]，也從蛙血清中分離出了一種分子量為1 638 Da的高純度小分子肽。因此，本研究探討了這種蛙血清小分子肽對腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

腦缺血再灌注引起的腦組織損傷及功能障礙是一個很復(fù)雜的病理生理過程，細(xì)胞凋亡是其中的一個重要形式[8]。本研究中通過TUNEL染色對腦組織細(xì)胞凋亡的情況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)高、中劑量小分子肽組的TUNEL陽性細(xì)胞明顯減少，表明小分子肽可抑制腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡，其對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用的機(jī)制之一是抑制細(xì)胞凋亡。

與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切的蛋白主要有兩大類：一類是促凋亡蛋白，包括Bax、Cytc和Caspase-3；另一類是抗凋亡蛋白，包括Bcl-2等。這兩類蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱決定了細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度。Bax與Bcl-2是一對拮抗蛋白[9]，構(gòu)成細(xì)胞凋亡的一個重要調(diào)控點(diǎn)。Bax起促凋亡作用[10]，而Bcl-2起抗凋亡作用[11]。Bcl-2蛋白通過減少Cytc向細(xì)胞質(zhì)的釋放以及抑制Capase-3的激活保護(hù)腦組織，缺血再灌注損傷腦組織中Bcl-2的高表達(dá)是抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵。Cytc是細(xì)胞凋亡發(fā)生的閥門，Cytc與dATP、Aapf-1和Procaspase-9組成聚合體，稱為凋亡體。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的最終效應(yīng)因子和執(zhí)行者[12]。Cytc與Caspase-3在腦缺血再灌注24 h均達(dá)到最高峰值，Cytc開始逐漸下降，而Caspase-3的高表達(dá)一直持續(xù)到缺血后3 d[13]，且Cytc與Caspase-3的表達(dá)與凋亡細(xì)胞的分布一致[14]。

本研究采用了免疫組織化學(xué)檢測腦組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Cytc、Caspase-3的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小分子肽治療組的促凋亡蛋白Bax、Cytc、Caspase-3的表達(dá)均比模型組顯著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)比模型組顯著升高，說明小分子肽能顯著抑制促凋亡蛋白Bax、Cytc、Caspase-3的活性，升高抗凋亡蛋白Bcl-2的活性，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展。由此可知，蛙血清小分子肽能減少腦細(xì)胞的凋亡，保護(hù)缺血再灌注損傷，且存在量效依賴關(guān)系，其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制與抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

小分子肽是很有開發(fā)應(yīng)用前景的藥物。在本研究中，蛙血清小分子肽能減少缺血再灌注損傷腦細(xì)胞凋亡的數(shù)目，同時增強(qiáng)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Bax、Cytc、Caspase-3蛋白表達(dá)，說明該小分子肽對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用是通過抑制細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。因此，該小分子肽必定有著很好的臨床應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步深入研究。

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Effects of frog serum small molecular peptide on apoptosis in rats with cerebral ischemia reperfusion injury.

CHEN Bo1,XIE Lin2.Laboratory of Physiological Science1,Basic Medical College2,Dongguan Campus,Guangdong Medical University,Dongguan 523808,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of small molecular peptide of frog serum on apoptosis and apoptosis related proteins in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury,and to analyze the possible mechanism.MethodsA total of 100 male SD rats were randomly divided into five groups according to the random number table:sham operation group,model group and frog serum small peptide with high dose group(90 mg/kg,high dose group),middle dose group (30 mg/kg),low dose group(10 mg/kg),with 20 rats in each group.Using artery suture embolization in the rat brain to establish the rat model of ischemia reperfusion injury,the rats were scored for neurological behavior after ischemia 2 h reperfusion 24 h and then sacrificed.Apoptosis was detected by TUNEL method.Immunohistochemical method were applied to observe the levels of B cell lymphoma/lewkmia-2(Bcl-2),Bcl associated x protein(Bax),Cytochrome c(Cytc), cystinyl aspartate specific protease(Caspase-3).ResultsThe neurological behavior score was(0.00±0.00)in sham operation group,(2.38±0.78)in model group,(1.47±0.41)in high dose group,(1.68±0.52)in middle dose group,(2.01± 0.66)in low dose group,which was significantly lower in high dose group and middle dose group than model group(P＜0.05).The apoptotic cell count was(3.37±1.10)in sham operation group,(42.80±3.54)in model group,(28.00±2.28)in high dose group,(32.40±3.26)in middle dose group,(41.40±1.20)in low dose group,which was significantly lower in high dose group and middle dose group than model group(P＜0.05).The expression levels of apoptosis-related protein Bax,Cytc,Caspase-3 and Bcl-2 were(3.01±1.12),(2.58±1.74),(2.34±1.37),(65.42±3.65)in sham operation group, (70.67±3.06),(58.31±5.04),(68.04±5.85),(31.26±2.81)in model group,(40.56±4.52),(33.65±3.44),(41.56±4.52), (55.64±5.49)in high dose group,(47.29±5.04),(38.09±4.24),(47.29±5.04),(48.33±4.26)in middle dose group, (53.20±4.70),(44.53±4.39),(53.20±4.70),(40.35±3.17)in low dose group.The high,middle,low dose group could inhibit the expression of Bax,Cytc and Caspase-3 protein and increase the expression of Bcl-2 protein,showing statistically significant difference with model group(P＜0.05).The effect of high dose group was the best,and there was a dose-dependent effect.ConclusionFrog serum small molecular peptide can enhance the expression of Bcl-2 protein and inhibit the expression of Bax,Cytc,Caspase-3 protein,and thus reduce the number of neuronal apoptosis,improve neurological symptoms,protect the cerebral ischemia-reperfusion injury.

Rats;Frog serum;Small molecular peptide;Cerebral ischemia reperfusion;Cell apoptosis;Mechanism

R-332

A

1003—6350（2016）07—1036—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.07.002

2015-12-15)