林春雨

（廣東省湛江市第一中醫(yī)院 兒科，廣東 湛江 524000）

慢性腦缺血是指由多種因素綜合作用導(dǎo)致的機(jī)體長期腦血流灌注不足，為老年性癡呆、動靜脈畸形及血管性癡呆等疾病發(fā)生的主要危險因素之一[1]。相關(guān)醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)果顯示，近年來我國慢性腦缺血患者的發(fā)病率不斷升高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，威脅患者生命健康[2-3]?，F(xiàn)階段，國內(nèi)外越來越多的研究學(xué)者開始對慢性腦缺血的各種病理損傷機(jī)制進(jìn)行研究，并取得了良好的研究進(jìn)展，但尚無慢性腦缺血狀態(tài)下認(rèn)知功能與突觸相關(guān)蛋白-25（synaptosomal-associated protein 25, SNAP- 25）表 達(dá)的研究報道[4]。基于上述研究現(xiàn)狀，本次研究對慢性腦缺血大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力與前額葉皮質(zhì)SNAP-25蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性進(jìn)行了探討，旨在進(jìn)一步明確慢性腦缺血引起認(rèn)知功能損害的作用機(jī)制，為慢性腦缺血性疾病的防治提供理論依據(jù)和新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究選用我省醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供的SPF級40只SD大鼠作為研究樣本，40只大鼠均在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)條件下喂養(yǎng)，生長環(huán)境自然采光，進(jìn)食、飲水自由，體重為250～300 g，平均體重為（273.5±8.6）g。隨機(jī)抽取20只健康大鼠建立慢性腦缺血大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并將該組大鼠設(shè)為試驗(yàn)組，將另外20只健康大鼠設(shè)為對照組，兩組大鼠日齡、體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 建立腦缺血大鼠試驗(yàn)?zāi)Ｐ?建立模型前禁食12 h，禁水4 h，給予大鼠腹腔注射5%水合氯醛進(jìn)行麻醉，用藥劑量為0.35 ml/100 g。麻醉成功后，將實(shí)驗(yàn)大鼠固定為仰臥位，逐層分離頸前部皮膚、肌肉，暴露并分離大鼠雙側(cè)頸動脈及迷走神經(jīng)，完成后使用4號絲線常規(guī)縫合，肛溫維持在36～37℃，繼續(xù)進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，術(shù)后2個月進(jìn)行行為評價和免疫組化測定。

1.2.2 空間學(xué)習(xí)記憶能力評估方法 采用Morris水迷宮試驗(yàn)評估兩組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，本次研究使用的水迷宮由一個圓形水池和一個隱藏在水面下2 cm的平臺組成。圓形水池的直徑為1.5 m，高度為0.5 m，將水溫設(shè)置為24℃。水面下平臺的直徑為0.1 m，高度為0.27 m。另配備攝像機(jī)和計算機(jī)。進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)期間，保持水迷宮內(nèi)外的參照物位置不變，兩組大鼠均訓(xùn)練5 d，每天分上、下午兩段訓(xùn)練，每段訓(xùn)練4次，間隔1 h訓(xùn)練一次。采用定位航行試驗(yàn)評估大鼠的學(xué)習(xí)能力，訓(xùn)練時，將大鼠面向圓形水池池壁緩慢放入術(shù)中，準(zhǔn)確記錄大鼠四肢登上水下平臺的時間，設(shè)定大鼠的游泳時間為2 min，在水下平臺停留的時間為5 s，若大鼠在下水后2 min內(nèi)仍未登上水下平臺，則記錄逃避潛伏期為2 min。采用空間探索試驗(yàn)評估大鼠的記憶能力，在兩組大鼠學(xué)會尋找水下平臺后，將水下平臺撤出，然后再將大鼠放入水中，記錄大鼠2 min內(nèi)穿越目標(biāo)區(qū)域的次數(shù)。

1.2.3 前額葉皮質(zhì)SNAP-25檢測方法 兩組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力評估結(jié)束后，將大鼠斷頭處死，冰上迅速分離前額葉腦組織，置于4%的多聚甲醛溶液中固定，固定時間為48 h，進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋，冠狀切片5 μm，使用35℃水漂展開后，貼在干預(yù)處理的載玻片上，石蠟片在60℃的烤箱中烘烤20 min后進(jìn)行脫蠟染色，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）為陰性對照，在4℃的環(huán)境中孵育過夜，在室溫暗環(huán)境下顯色，使用顯微鏡觀察染色情況。使用生物圖像分析系統(tǒng)分析前額葉皮質(zhì)SNAP-25免疫反應(yīng)產(chǎn)物的光密度 值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

本院本次研究得到的呈正態(tài)分布的研究數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 13.0處理，量性觀察指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以t檢驗(yàn)進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，慢性腦缺血大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力與前額葉皮質(zhì)SNAP-25蛋白表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行Logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果比較

經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組大鼠的逃逸潛伏期明顯長于對照組大鼠（P＜0.05），撤出水下平臺后穿越目標(biāo)區(qū)域的次數(shù)明顯少于對照組大鼠，組間比較存在的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），具體研究數(shù)據(jù)見表1所示。

表1 兩組大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果比較 （±s）

表1 兩組大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果比較 （±s）

組別 例數(shù) 逃逸潛伏期/秒 穿越目標(biāo)區(qū)域次數(shù)/次試驗(yàn)組 20 45.9±8.3 2.8±0.5對照組 20 26.5±6.4 3.2±0.6 t值 8.278 2.290 P值 0.000 0.028

2.2 前額葉皮質(zhì)SNAP-25蛋白表達(dá)水平比較

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組大鼠的前額葉皮質(zhì)SNAP-25蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組大鼠（P＜0.05），詳見表2所示。

表2 兩組大鼠的前額葉皮質(zhì)SNAP-25蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 兩組大鼠的前額葉皮質(zhì)SNAP-25蛋白表達(dá)水平比較（±s）

組別 例數(shù) SNAP-25蛋白表達(dá)水平試驗(yàn)組 20 1 345.69±39.81對照組 20 963.36±21.95 t值 37.612 P值 0.000

2.3 慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能損害程度與前額葉皮質(zhì)SNAP-25蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性

觀察發(fā)現(xiàn)大鼠認(rèn)知功能損害程度越高，前額葉皮質(zhì)SNAP-25蛋白表達(dá)水平越高，Logistic回歸分析結(jié)果顯示大鼠認(rèn)知功能損害程度與前額葉皮質(zhì)SNAP-25蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)性，具體研究數(shù)據(jù)見表3。

表3 慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能損害程度與前額葉皮質(zhì)SNAP-25蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討論

臨床觀察發(fā)現(xiàn)慢性腦缺血患者起病具有隱匿性，病情發(fā)展較為緩慢，發(fā)病早期病理改變以認(rèn)知功能輕度損害為主，隨著病情的不斷發(fā)展，可發(fā)生能量代謝障礙、蛋白質(zhì)合成異常及神經(jīng)元缺失等病理改變，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能發(fā)生嚴(yán)重?fù)p害[5-6]。前額葉皮質(zhì)是機(jī)體學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體發(fā)生慢性腦缺血后，突觸的可塑性會受到影響，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)釋放所必需的突觸前血漿膜蛋白SNAP-25在前額葉皮質(zhì)中的表達(dá)水平升高，并直接參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放和神經(jīng)元細(xì)胞可塑性的調(diào)節(jié)[7-8]。因此本院推測慢性腦缺血患者機(jī)體空間學(xué)習(xí)記憶能力與前額葉皮質(zhì)SNAP-25的蛋白表達(dá)存在一定程度的相關(guān)性。

為驗(yàn)證上述推測結(jié)果的客觀性和準(zhǔn)確性，本院建立實(shí)驗(yàn)動物模型，開展了實(shí)踐研究。Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)結(jié)果顯示試驗(yàn)組大鼠的逃逸潛伏期明顯長于對照組健康大鼠，空間探索試驗(yàn)結(jié)果顯示試驗(yàn)組大鼠的目標(biāo)區(qū)域穿越次數(shù)明顯少于對照組大鼠，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示試驗(yàn)組大鼠的前額葉皮質(zhì)SNAP-25的蛋白水平明顯高于對照組大鼠。采用Logistic回歸分析對慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能損害程度與前額葉皮質(zhì)SNAP-25蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，兩者呈正相關(guān)性，即大鼠認(rèn)知功能損害越嚴(yán)重，前額葉皮質(zhì)SNAP-25的蛋白表達(dá)水平越高。

綜上所述，雖然本研究結(jié)果證實(shí)了本院上述推測的客觀性，但由于現(xiàn)階段我國醫(yī)療領(lǐng)域關(guān)于該課題的臨床研究較少，本次研究所得結(jié)果的指導(dǎo)意義仍需臨床通過大量實(shí)踐研究進(jìn)行證明。

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