董 菲 綜述，孫成銘 審校

(1.青島大學,山東青島 266000；2.青島大學醫(yī)學院附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院檢驗中心,山東煙臺264000)

·綜 述·

節(jié)律基因在腫瘤中的研究進展*

董 菲1綜述，孫成銘2△審校

(1.青島大學,山東青島 266000；2.青島大學醫(yī)學院附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院檢驗中心,山東煙臺264000)

生物晝夜節(jié)律； 節(jié)律基因； 腫瘤； 細胞周期； 凋亡

生物晝夜節(jié)律是生物體內(nèi)具有自我調(diào)節(jié)功能、以生命活動24 h為周期的一種生理節(jié)律系統(tǒng)，因其節(jié)律特性類似于鐘表而被叫做生物鐘。生物晝夜節(jié)律依照周期的長短分為亞日節(jié)律(ultradian rhythm)，周期短于1 d，如呼吸、心跳等；近日節(jié)律(circadian rhythm)，周期接近于24 h，如體溫、血壓、血細胞數(shù)量、激素分泌等；超日節(jié)律(infradian rhythm)，周期超過1 d，以月、年為周期，如遷徙、繁殖和冬眠等。近日節(jié)律是研究、應用最多的節(jié)律行為。生物晝夜節(jié)律調(diào)控著生物的生理、代謝和行為，與人類健康有著密切的關系，其異?？蓪е录膊』蚰[瘤的發(fā)生。近幾年來隨著科學技術的發(fā)展和人類認知水平的提高，興起了研究生物晝夜節(jié)律的學科——時間生物學(Chronobiology)。時間生物學不斷與多種學科交叉，為生命科學的探索注入了新鮮的血液。從20世紀70年代開始，隨著分子生物學和蛋白質(zhì)組學的發(fā)展，調(diào)控生物晝夜節(jié)律的基因相繼被發(fā)現(xiàn)和研究應用，生物節(jié)律及其機制研究有了突破性的進展，其在腫瘤發(fā)生和進展中的作用也不斷顯現(xiàn)?，F(xiàn)就生物晝夜節(jié)律基因的分子生物學機制及其在腫瘤中的研究進展作一綜述。

1 節(jié)律基因調(diào)節(jié)生物節(jié)律的分子生物學機制

生物鐘的功能是通過某些組織特異性基因的節(jié)律表達來一步步實現(xiàn)的，這些基因被稱作節(jié)律基因或鐘基因。迄今為止，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的節(jié)律基因主要有Per1/2/3(Period1/2/3)、Tim(Timeless)、Clock、Npas2、Cry1/2(Crytochrome1/2)、Bmal1(brain and muscle ARNT-like-1)、孤兒核受體Rev-Erbα、Rorα(retinoic acid receptor-related orphan receptor α)、CKIε(Casein kinase 1ε)和Dec1/2(Differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 1/2)等。生物節(jié)律的內(nèi)源性機制主要由3個部分組成：(1)生物振蕩器，由一組呈節(jié)律表達的基因及編碼的蛋白質(zhì)組成；(2)輸入系統(tǒng)，接受信號傳入到振蕩器，調(diào)控相關基因的表達，光照、溫度和食物都可以作為輸入信號來調(diào)節(jié)和重置節(jié)律；(3)輸出系統(tǒng)，由鐘基因和一些鐘控基因[1](如c-Myc，cyclin D，Wee1)及其蛋白產(chǎn)物組成，負責信號的輸出。哺乳動物的主生物鐘位于下丘腦的視交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)[2]，不同的物種對于生物節(jié)律的調(diào)節(jié)具有相似性，其基本模式都是由正調(diào)控元件和負調(diào)控元件組成的轉(zhuǎn)錄翻譯反饋回路(transcription-translation feedback loops，TTFL)組成。

1.1 節(jié)律基因參與的反饋回路 真核生物的正向調(diào)控因子為Clock、Bmal1和Rora，能啟動負調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄；負向調(diào)控因子為Per 1/2/3和Cry 1/2，當負調(diào)控蛋白達到一定的水平后，則通過負反饋回路抑制正向調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄激活；隨后負調(diào)控蛋白被磷酸化和降解，正調(diào)控基因又重新啟動轉(zhuǎn)錄。Bmal1是調(diào)節(jié)生物節(jié)律的重要轉(zhuǎn)錄因子，位于時鐘體系的上游。BMAL1蛋白是正反饋回路的調(diào)節(jié)因子之一，分子伴侶是CLOCK 蛋白，兩者都含有BHLH-PAS(basic helix-loop-helix,Period-Arnt-Single minded)結構域而具有與靶基因 DNA 轉(zhuǎn)錄激動結構E-box(enhancer box)5′-CAC GTG-3′結合進而促進其轉(zhuǎn)錄的能力。其具體分子水平調(diào)節(jié)機制如下所述。

1.1.1 核心通路 該反饋回路包括Per(Per1、2、3)和Cry(Cry1、2)。Bmal1基因作為時鐘體系的起始因子，其產(chǎn)物BMAL1與CLOCK在bHLH 的介導下形成BMAL1/CLOCK異二聚體[3]。此二聚體通過結合Per和Cry基因啟動子的E-box元件來激活基因轉(zhuǎn)錄，形成產(chǎn)物PER和CRY，在細胞質(zhì)中組成PER/CRY復合物，隨后PER/CRY復合物被轉(zhuǎn)入神經(jīng)核內(nèi)，抑制BMAL1/CLOCK的活性，進而抑制自身基因的轉(zhuǎn)錄[4-5]。Npas2是Clock的同源基因，其蛋白產(chǎn)物與BMAL1形成異二聚體，促進Per和Cry基因的轉(zhuǎn)錄，從而維持生物節(jié)律[6]。

1.1.2 輔助通路 該反饋回路包括Rev-erb和Ror，產(chǎn)物為ROR (α、β、γ) 和REV-ERB (α、β) 蛋白，是核受體亞家族的成員。RORs作為轉(zhuǎn)錄激活因子，REV-ERBs作為轉(zhuǎn)錄抑制因子[7]，兩者分別識別并結合位于靶基因上的ROREs調(diào)控元件。BMAL1/CLOCK與Ror及Rev-erb的E-box元件結合并激活其轉(zhuǎn)錄，隨后RORs和REV-ERBs反過來結合位于Bmal1上ROREs的啟動子來調(diào)節(jié)Bmal1的節(jié)律性表達[7]。

1.1.3 其他通路 節(jié)律系統(tǒng)也通過一些節(jié)律控制相關基因來影響其他生理過程。如核受體基因(the peroxisome proliferator-actived receptors α，PPARα)和PPAR γ[8]；細胞周期基因c-MYC、WEE1、 cyclinD和p21等。

1.2 節(jié)律基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯后調(diào)控 生物鐘遵循著接近24 h的節(jié)律，這種節(jié)律的維持不僅與節(jié)律基因的轉(zhuǎn)錄有關，更與轉(zhuǎn)錄后對于mRNA和蛋白質(zhì)水平的調(diào)節(jié)有關[9]。鐘基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控主要表現(xiàn)在：(1)mRNA的選擇性剪接；(2)多聚腺苷酸化水平的調(diào)控，如SCN中加壓素mRNA的轉(zhuǎn)錄水平是嚴格受到晝夜節(jié)律性調(diào)控的；(3)mRNA代謝轉(zhuǎn)化調(diào)控[9]。生物鐘基因的翻譯后調(diào)控主要表現(xiàn)在：(1)細胞質(zhì)中的磷酸化作用，如DBT使PER磷酸化，通過調(diào)節(jié)PER的穩(wěn)定性和PER-TIM復合物進核時間影響果蠅生物鐘基因表達的時相[10]；(2)細胞核中的磷酸化作用，許多生物鐘元件的磷酸化過程主要發(fā)生在細胞核中[11]。另外，乙酰化[12]、泛素化[13]等表觀遺傳學修飾也在一定程度上參與了鐘基因翻譯后的調(diào)控。

2 生物晝夜節(jié)律與腫瘤的關系

生物節(jié)律的變化可使機體節(jié)律振幅延長或縮短，造成機體與環(huán)境失同步，導致節(jié)律失常性疾病。大量的流行病學研究發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂使節(jié)律基因表達異常并增加了腫瘤的易感性，包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、結直腸癌和血液系統(tǒng)腫瘤等。世界衛(wèi)生組織屬下的“國際癌癥研究機構”專家小組將常導致晝夜節(jié)律紊亂的夜班工作列為了致癌因素之一，由此可見，晝夜節(jié)律紊亂引起的節(jié)律基因異常對腫瘤的發(fā)生具有重要作用。

2.1 節(jié)律基因在腫瘤中的表達 Per基因作為分子鐘反饋回路中的重要基因，在大部分的腫瘤中是低表達的，如肝細胞癌(HCC)[14]、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)[15]、乳腺癌[16]、胰腺癌[17]、結直腸癌(CRC)[18]和膠質(zhì)瘤[19]等，因此Per基因常被認為是一種腫瘤抑制基因。Zhao等[20]對246例胃癌(GC)患者研究發(fā)現(xiàn)其Per1、Per2表達水平是下降的，并且Per2表達越低患者的生存期越短。與此相反，Hu等[21]的研究顯示GC中Per2表達水平顯著上調(diào)，并且Per3的表達水平與腫瘤患者的生存相關。研究發(fā)現(xiàn)，Cry1在GC[21]和CRC[22]晚期患者中的表達水平升高，并且與CRC患者預后呈正相關，過表達Cry1基因可促進CRC細胞增殖和遷徙。在其他腫瘤如肺癌、黑色素瘤和前列腺癌等惡性腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了生物鐘基因或其振蕩節(jié)律的異常[23]。

節(jié)律基因除了在實體腫瘤中表達異常，在惡性血液腫瘤中也存在著表達變化。研究顯示，Per2在急性髓細胞白血病(AML)患者中的表達明顯降低，Per2的異?？赡軈⑴cAML的起始和進展[24]。慢性粒細胞白血病(CML)慢性期和急變期Per1、Per2、 Per3、Cry1、 Cry2、 Cki和 Bmal1表達顯著受損，而Clock和Tim基因的表達變化無時間依賴差異[25]。體外培養(yǎng)細胞發(fā)現(xiàn)Per2可通過阻斷細胞周期和誘導凋亡來抑制K562細胞生長[26]。PER2還作為CCAAT增強子結合蛋白α(C/EBPα)的直接下游靶標在AML[27]和彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)[27]的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著作用。病例報告顯示，非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者喪失了正常的睡眠節(jié)律，對其遺傳和功能分析提示CRY2可能對NHL的發(fā)展有重要作用[28]。研究證明CRY可作為慢性淋巴細胞白血病(CLL)疾病進展早期預測指標，其中CRY1：PER2可作為CLL的獨立預后指標[29]。

2.2 節(jié)律基因在腫瘤中的作用機制

2.2.1 節(jié)律基因參與細胞周期

2.2.1.1 c-Myc c-Myc作為癌基因參與G0/G1期轉(zhuǎn)換，是細胞周期的關鍵性調(diào)節(jié)因子，它通過調(diào)控細胞周期蛋白E(Cyclin E)/細胞周期依賴性蛋白激酶2(Cdk2)復合物的活性參與細胞周期。c-Myc啟動子含有E-box可被CLOCK/BMAL1結合，直接抑制c-Myc的轉(zhuǎn)錄[30]。

2.2.1.2 Cyclin D1/E Cyclin D1/E是G1/S期轉(zhuǎn)換基因，決定細胞進入分裂期還是靜止期。CyclinD1與Cdk形成復合物CyclinD1/Cdk4-6，使抑癌基因pRb蛋白磷酸化，細胞從G1期進入S期，促使細胞增殖。CyclinD1受生物鐘調(diào)控，晝夜節(jié)律的紊亂可導致CyclinD1表達異常[31]。CyclinE是細胞周期的啟動基因，可被CLOCK-BMAL1直接抑制，阻斷CyclinE/Cdk2復合物的形成，從而阻止細胞G1/S期轉(zhuǎn)換。

2.2.1.3 Wee1 Wee1為G2/M期轉(zhuǎn)換基因。Wee1啟動子含有E-box，受CLOCK/BMAL1復合物的正向調(diào)控。Bmal1表達達峰值時可激活Wee1，Wee1磷酸化失活CDK，激活CyclinB1，促使細胞從G2到M期轉(zhuǎn)換。

2.2.1.4 p21 p21作為Cdks的抑制劑，能夠被BMAL1調(diào)控的REV-ERBα蛋白抑制表達，從而激活Cdk1和Cdk2，促進細胞向S期和M期發(fā)展。

2.2.2 節(jié)律基因參與細胞凋亡 p53反應元件與E-Box有重疊，可阻止BMAL1/CLOCK與Per2的啟動子結合[32]。過表達RORα可明顯增加p53蛋白穩(wěn)定性，從而增強p53功能，促進細胞凋亡[33]。敲除膠質(zhì)瘤細胞的Clock基因可改變凋亡相關基因的表達，c-Myc和Cyclin B1蛋白表達降低，p53表達升高，導致細胞增殖降低、凋亡加速[34]。最近的研究表明，Cry還參與腫瘤壞死因子α(TNFα)的合成并激活凋亡通路[35]。這些結果提示鐘基因與腫瘤細胞的凋亡過程密不可分。

3 小 結

如上所述，節(jié)律基因通過復雜的調(diào)控機制對腫瘤產(chǎn)生重要的影響。近年來，科研人員不斷對節(jié)律基因進行多學科交叉研究，使生物節(jié)律在中、西醫(yī)學和空間治療學中(重力的變化可能會影響生物的節(jié)律[36])發(fā)揮作用，產(chǎn)生了新的相關學科如時間藥理學、時間治療學等。研究者可以利用節(jié)律基因在不同腫瘤及不同時間的表達水平變化，設計靶向藥物，從而達到治療腫瘤的目的。然而，利用鐘基因?qū)δ[瘤實施靶向治療既是機遇又是挑戰(zhàn)，同時也存在制約性。靶向治療忽略了藥物靶標維護機體穩(wěn)定性的基本生理功能，有可能使原來不平衡的體系更加惡化，從而給患者帶來潛在的甚至致命的危險[37]。因此，最大限度地增加腫瘤的靶向效率和保護正常宿主細胞是成功應用靶向藥物抵抗腫瘤的最大的挑戰(zhàn)。生物節(jié)律本身還有無窮的奧妙有待人們?nèi)パ芯块_發(fā)，因此需對生物節(jié)律展開更加深入的探索，人類必將更加重視并利用其研究成果。

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山東省英才基金項目(2015ZRA06016)。

董菲，女，碩士，主要從事白血病的發(fā)病機制研究。

△，E-mail：18953569897@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.028 文獻標識碼：A 文章編號：1673-4130(2016)07-0941-04

2015-11-28)