郭利華

(成都艾迪康醫(yī)學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室有限公司　610037)

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PCR實(shí)驗(yàn)室的污染及控制措施

郭利華

(成都艾迪康醫(yī)學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室有限公司610037)

目的分析PCR實(shí)驗(yàn)室污染途徑。方法針對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)室不同的污染途徑采取不同的控制措施。結(jié)果通過(guò)一系列控制措施，達(dá)到了有效預(yù)防和控制污染的發(fā)生。結(jié)論P(yáng)CR實(shí)驗(yàn)由于具有高靈敏度，容易產(chǎn)生污染，必須針對(duì)不同污染途徑采取不同控制措施,以避免污染產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。

聚合酶鏈反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)室污染；控制措施

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是20世紀(jì)80年代慢慢發(fā)展起來(lái)的一種體外基因擴(kuò)增技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)在人體外可在很短的一定時(shí)間內(nèi)將極微量的靶核酸擴(kuò)增上百萬(wàn)倍，得到大量特定目的基因片段。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)具有特異、快速、敏感、產(chǎn)率高、易自動(dòng)化、高通量、簡(jiǎn)便等突出優(yōu)點(diǎn)，已成為臨床實(shí)驗(yàn)室常用的操作技術(shù)之一[1-2]。PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重點(diǎn)應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)和預(yù)防醫(yī)學(xué)中[3]，大多數(shù)病原體都可通過(guò)PCR檢測(cè)為人類疾病的防治提供新的檢測(cè)手段，但在實(shí)際PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程中極易發(fā)生污染，引起結(jié)果的假陽(yáng)性。為保證結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，結(jié)合有關(guān)資料和工作經(jīng)驗(yàn)分析PCR實(shí)驗(yàn)室污染產(chǎn)生的途徑及控制措施。

1　PCR實(shí)驗(yàn)室常見污染途徑

由于PCR技術(shù)敏感性特高，所以要求更高，影響因素也非常多，從樣品開始采集到結(jié)果報(bào)告發(fā)出，任何一處細(xì)小的失誤都會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的偏差，極其微量的污染都容易導(dǎo)致樣品出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。產(chǎn)生污染的主要途徑包括4個(gè)方面：(1)是PCR試劑污染。主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中，由于加樣器、容器、水及其他溶液被PCR核酸模板污染。(2)是標(biāo)本間交叉污染。①收集標(biāo)本的容器被污染。②標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外。③容器外黏有標(biāo)本造成相互間交叉污染。④標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中，由于吸樣器污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染。⑤有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠而擴(kuò)散導(dǎo)致污染。(3)是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染。這是PCR中最常見的污染問(wèn)題，因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染就可形成假陽(yáng)性。(4)是實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染。在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的實(shí)驗(yàn)室，這個(gè)問(wèn)題也比較常見。克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)濃度高，另外在純化過(guò)程中需要較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及其具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大[4]。由于一旦發(fā)生基因?qū)嶒?yàn)室污染，該實(shí)驗(yàn)就必須要停止，花費(fèi)大量物力、人力直到尋找污染源為止，而且實(shí)驗(yàn)報(bào)告結(jié)果必須作廢，需重新操作實(shí)驗(yàn)，結(jié)果才可靠。

2　PCR污染的控制措施

2.1工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分

2.1.1各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)置合理，根據(jù)《CNAS-CL36醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》要求，合理分隔實(shí)驗(yàn)室。將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意標(biāo)本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其他步驟嚴(yán)格分開。最好能劃分：標(biāo)本處理區(qū)，PCR反應(yīng)液制備區(qū)，PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū)，PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA[5]。

2.1.2各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域要對(duì)不同設(shè)備、物品顏色有明顯的標(biāo)記，如各區(qū)域使用專門的工作服、工作鞋、垃圾桶、拖把、抹布、筆等，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。

2.2使用一次性用具吸頭、離心管、無(wú)粉塵手套、口罩等均為一次性使用。

2.3規(guī)范的系統(tǒng)設(shè)置設(shè)置規(guī)范的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)，盡可能采用全送全排空調(diào)系統(tǒng)。在進(jìn)入各個(gè)操作區(qū)域需要嚴(yán)格單一流向進(jìn)行，即試劑準(zhǔn)備和貯存區(qū)→樣品制備區(qū)→PCR擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，不得逆行。

2.4污染監(jiān)測(cè)需要設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照，進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，選擇不相同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增等，做好污染監(jiān)測(cè)，以便采取措施防止和消除污染。

2.5規(guī)范操作

2.5.1PCR實(shí)驗(yàn)室人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)，取得外部和內(nèi)部上崗證后，方可從事基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作。

2.5.2在操作中勤換手套，且不能與管蓋內(nèi)面接觸。吸頭、離心管裝上濾嘴才能用。

2.5.3要正確操作相關(guān)儀器設(shè)備，認(rèn)真按照制訂的合理、科學(xué)的操作規(guī)程操作相關(guān)儀器設(shè)備，避免產(chǎn)生氣溶膠污染。

2.5.4取樣、加液(標(biāo)本、反應(yīng)液等)時(shí)應(yīng)先高速離心將管蓋上液體沉于管底，動(dòng)作輕快、以避免飛濺和產(chǎn)生氣溶膠污染環(huán)境。取樣應(yīng)就近操作，避免較遠(yuǎn)距離移樣。

2.5.5若在各區(qū)域操作發(fā)生試劑、樣品的外濺，此時(shí)工作人員先隔離其他未被污染的相關(guān)物品，戴上手套和生物防護(hù)裝置，用吸水紙吸干液體，對(duì)污染處用2 000 mg/L的次氯酸鈉消毒液覆蓋30 min，再用75%乙醇擦拭2遍，等試驗(yàn)結(jié)束后用紫外線照射39 min[6]。

2.5.6若發(fā)生實(shí)驗(yàn)室工作人員工作服、鞋、帽被污染時(shí)，必須立即脫掉并包裹好進(jìn)行消毒處理，換上另外消毒好的工作服、鞋、帽等后方可繼續(xù)工作。如果污染重則停止當(dāng)天的下一步工作或另?yè)Q其他具有資質(zhì)的人員進(jìn)行工作。

2.5.7清潔工作及時(shí)、準(zhǔn)確，每次實(shí)驗(yàn)前后用500 mg/L的含氯消毒液擦拭地面及工作臺(tái)面，75%乙醇擦拭儀器設(shè)備，再用紫外線照射整個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域及設(shè)備，時(shí)間不低于30 min。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的樣品溶液和擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的氣溶膠是重要的污染源，故PCR實(shí)驗(yàn)室要經(jīng)常通風(fēng)換氣和消毒。當(dāng)試驗(yàn)結(jié)束后產(chǎn)生的廢棄反應(yīng)管、槍頭等廢棄物應(yīng)置于2 000 mg/L的含氯消毒液中浸泡12 h以上。廢棄物需要經(jīng)高壓滅菌后按醫(yī)療廢物進(jìn)行消毒處理，避免污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

2.6科學(xué)合理的管理根據(jù)實(shí)際情況，制訂科學(xué)、合理的關(guān)于PCR相關(guān)制度文件、程序文件、標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程及記錄表格等文件，文件相關(guān)內(nèi)容一定要有科學(xué)性、前瞻性、、嚴(yán)謹(jǐn)性，并且操作性強(qiáng)，以便工作人員現(xiàn)場(chǎng)查閱和培訓(xùn)學(xué)習(xí)。

目前PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用，已經(jīng)得到長(zhǎng)足發(fā)展，成為臨床一些疾病診斷和預(yù)防控制領(lǐng)域的有力工具。為避免在PCR實(shí)驗(yàn)室內(nèi)出現(xiàn)污染、假陰性及假陽(yáng)性結(jié)果等現(xiàn)象，確保檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)該不斷提升檢測(cè)能力，具備應(yīng)對(duì)污染的能力，控制污染蔓延，將損失降到最小。

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[3]林萬(wàn)明.PCR技術(shù)操作和應(yīng)用[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2012.

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.067

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