崔丹丹 張麗雅 武昕

RhoC在外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌中的表達及意義

崔丹丹 張麗雅 武昕

目的探討RhoC在外陰鱗狀細胞癌(外陰鱗癌)及外陰硬化性苔蘚中的表達情況,分析其在外陰疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用。方法采用免疫組化方法檢測RhoC在外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌中的表達,并收集30例外陰鱗癌患者的臨床病理資料進行分析。結(jié)果RhoC在外陰正常組織、外陰硬化性苔蘚、外陰鱗癌中陽性細胞的平均光密度值分別為(22.42±1.23)、(36.07±2.75)、(83.51±2.84)。與外陰正常組織相比,RhoC在外陰硬化性苔蘚中的表達顯著增高(P<0.05)。在外陰鱗癌中的表達顯著高于其在外陰硬化性苔蘚與外陰正常組織中的表達 (P<0.05)。RhoC在Ⅰ～Ⅱ期外陰鱗癌組織中表達顯著低于Ⅲ～Ⅳ期(P<0.05),在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)。RhoC的表達與細胞分化及年齡無關(guān)。結(jié)論RhoC的表達與外陰鱗癌及外陰硬化性苔癬的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

RhoC；外陰鱗狀細胞癌；外陰硬化性苔蘚；免疫組化

RhoC是Rho基因家族的成員之一,其具有GTP酶活性。Rho蛋白在基因轉(zhuǎn)錄、細胞周期調(diào)控、調(diào)控細胞形態(tài)、細胞遷移、惡性腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移中起重要作用。據(jù)文獻報道RhoC在乳腺癌、肝細胞癌、胃癌、食管鱗癌、前列腺癌及非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤中異常表達,并與這些腫瘤的分期及轉(zhuǎn)移相關(guān)［1-4］。外陰硬化性苔癬(vulvar lichen sclerosus,VLS)是一種常見的外陰上皮內(nèi)非瘤樣病變,以40歲左右的婦女多見,其次是幼女,主要癥狀為外陰搔癢、性交痛及外陰燒灼感。其中約有4%～7%患有外陰硬化性苔蘚的婦女發(fā)展為外陰癌［5］。外陰鱗狀上皮癌占外陰惡性腫瘤的80%以上,約60%左右患者合并有外陰硬化性苔蘚［6］。目前兩種疾病的病因及發(fā)病機制尚未完全弄清,并且外陰硬化性苔蘚在什么情況下會進展為外陰鱗癌尚不清楚。因此本研究運用免疫組化的方法探討RhoC的表達與外陰硬化性苔癬和外陰鱗癌發(fā)生、發(fā)展是否相關(guān)?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年1月～2013年7月中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科55例患者經(jīng)手術(shù)切除及活檢存檔的蠟塊,其中包括30例外陰鱗癌,15例外陰硬化性苔蘚,10例正常外陰皮膚。所有患者臨床及病理資料均完整,所有標本均經(jīng)兩位資深病理醫(yī)師確認,術(shù)前均未行放化療。收集外陰鱗癌患者的臨床及病理資料進行統(tǒng)計分析：年齡36～68歲,平均年齡(52.8±5.9)歲。30例外陰鱗癌患者依據(jù)2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)臨床分期：Ⅰ期8例,Ⅱ期15例,Ⅲ期5例,Ⅳ期2例；分化程度：高分化18例,中分化7例,低分化5例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。

1.2 實驗試劑 兔抗人RhoC多克隆抗體、即用型SABC試劑盒、DAB顯色液均購自北京博奧森生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化 石蠟切片均進行常規(guī)的脫蠟水化。3% H2O2于室溫孵育10min從而滅活內(nèi)源性過氧化物酶,然后再進行抗原修復。滴加5%BSA封閉液,室溫20min,滴加適當一抗RhoC(1∶100)于4℃冰箱過夜,再滴加相對應(yīng)的二抗生物素化山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)孵育30min,鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物工作液室溫下孵育20min,最后進行DAB顯色,蘇木素復染,再進行封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3.2 結(jié)果判定 陽性染色判斷標準：光學顯微鏡下細胞漿或細胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒,運用BX60萬能顯微照相系統(tǒng)(OLYMPUS,日本)對切片進行圖像采集,每張切片中選取5個不同視野,利用顯微圖像分析系統(tǒng)Meta Morph(UIC/ OLUMPUS.US/JP)計算每張切片的平均積分光密度值。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RhoC在外陰不同組織中的表達情況 RhoC蛋白于細胞漿及細胞膜上呈棕黃色顆粒為陽性表達。正常外陰組織中能夠表達RhoC蛋白的細胞分布于基底細胞層,但在外陰硬化性苔蘚中陽性表達細胞位于表皮中上層,在真皮細胞中未見此蛋白表達。在外陰鱗癌中的表達主要分布在癌巢的異型細胞中。RhoC在外陰正常組織中陽性細胞的平均光密度值為(22.42±1.23),在外陰硬化性苔蘚中表達陽性細胞的平均光密度值為(36.07±2.75),外陰鱗癌中RhoC蛋白表達陽性細胞的平均光密度值為(83.51±2.84)。RhoC蛋白在外陰鱗癌、外陰硬化性苔蘚與外陰正常組織相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),并且其在外陰鱗癌中的表達顯著高于其在外陰硬化性苔蘚的表達 (P<0.05)。見表1。

表1 RhoC在外陰不同組織中的表達情況(±s)

表1 RhoC在外陰不同組織中的表達情況(±s)

注：與外陰正常組織比較,aP<0.05；與外陰硬化性苔蘚比較,bP<0.05

組織 例數(shù) 平均光密度值外陰正常組織 10 22.42±1.23外陰硬化性苔蘚 15 36.07±2.75a外陰鱗癌 30 83.51±2.84ab

2.2 RhoC的表達與外陰鱗癌的臨床病理特征的關(guān)系 RhoC在Ⅰ～Ⅱ期外陰鱗癌中表達為(74.13±2.73),Ⅲ～Ⅳ期為(89.69±1.23),比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在不同病理分級中表達為:高分化為(79.06±5.85),中低分化為(82.12±2.62)。不同病理分級比較差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中為(86.23±1.59),明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的(74.63±2.56)(P<0.05)；RhoC的表達與年齡無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 30例外陰鱗癌患者RhoC的表達與臨床病理特征的關(guān)系(±s)

表2 30例外陰鱗癌患者RhoC的表達與臨床病理特征的關(guān)系(±s)

注：不同臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較,aP<0.05

指標 例數(shù) RhoC P年齡 ≤45歲 7 82.50±1.70 >0.05 >45 23 80.32±2.01臨床分期 Ⅰ～Ⅱ期 23 74.13±2.73a<0.05Ⅲ～Ⅳ期 7 89.69±1.23病理分級 高分化 18 79.06±5.85 >0.05中低分化 12 82.12±2.62淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無 22 74.63±2.56a<0.05有8 86.23±1.59

3 討論

在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中,細胞因子間的信號轉(zhuǎn)導起著至關(guān)重要的作用。研究顯示［6］,Ras超家族中Rho亞家族是細胞信號轉(zhuǎn)導過程中的重要因子,其在腫瘤細胞生物學行為中主要是參與細胞骨架重組、應(yīng)力纖維形成及調(diào)節(jié)細胞形狀、極性、運動等。研究者根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能不同,將已發(fā)現(xiàn)的約20個Rho GTP酶超家族成員的大致分為5個亞家族,包括Rho亞家族,此亞家族又包括RhoA、RhoB 及RhoC三位成員。研究表明在大多數(shù)原發(fā)腫瘤中,RhoC發(fā)揮積極的調(diào)節(jié)作用。RhoC全稱為Ras同源類似物C,RhoC的CDS全長為582bp,在基因組中的全長約為5 kb,定位于染色體1p21-p13。RhoC蛋白含193個氨基酸。RhoC 蛋白在細胞的多種生命過程均積極參與,其中最為重要的是調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架活動,其中,RhoC蛋白與樁蛋白(paxillin)、粘著斑激酶(FAK)、內(nèi)收蛋白(adducing)和肌球蛋白輕鏈(myosin lightchain,MLC)等細胞骨架相關(guān)蛋白的磷酸化直接相關(guān),并且還參與了細胞運動和遷移的調(diào)節(jié)。RhoC蛋白通過向下游靶效應(yīng)分子ROCK (Rho associated coiled coil forming protein kinase,ROCK)傳遞活化信號,繼而磷酸化多個氨基酸位點,激活并介導下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應(yīng)［7,8］。通過以上途徑對調(diào)控細胞骨架的重建,同時參與并影響細胞遷移、增殖、轉(zhuǎn)錄、惡性腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和浸潤等多種生物學行為［9］。

在人類的惡性腫瘤中,有報道稱對RhoC蛋白在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、膀胱癌中過度表達,與之相一致,研究發(fā)現(xiàn)RhoC蛋白在外陰正常組織中弱表達,在外陰硬化性苔蘚及外陰癌中高表達,而且與外陰正常組織相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),推測其與外陰硬化性苔蘚及外陰癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。其可能通過調(diào)節(jié)細胞凋亡及細胞轉(zhuǎn)錄等生物學行為在外陰硬化性苔蘚病變的發(fā)生過程中發(fā)揮一定的作用,具體調(diào)節(jié)機制則有待進一步研究探討。另外,RhoC 蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期高的外陰癌病例中高表達。RhoC蛋白促進惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的機制可能如下：①RhoC 蛋白通過 ROCK 信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)肌動蛋白微絲骨架的聚合過程,進而影響細胞形態(tài)和極性,此通路還能促進惡性腫瘤血管生成、協(xié)助腫瘤細胞穿越脈管內(nèi)皮從而實現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移［10,11］；②RhoC 蛋白可通過影響細胞-細胞間、細胞-胞外基質(zhì)的粘附從而參與調(diào)節(jié)細胞遷移；③RhoC 蛋白可以影響金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的水平,進而調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)(extraceller matrix,ECM)的降解及重建,促進局部浸潤的發(fā)生；④RhoC蛋白可以激活磷脂酶 C(PLC)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)等多種酶類的信號轉(zhuǎn)導途徑,促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。

［1］Rosenthal DT,Zhang J,Bao L,et al.RhoC Impacts the Metastatic Potential and Abundance of Breast Cancer Stem Cells.Plos One,2012,7(7):e40979.

［2］Xie S,Zhu M,Lv G,et al.Overexpression of Ras Homologous C (RhoC) Induces Malignant Transformation of Hepatocytes In Vitro and in Nude Mouse Xenografts.Plos One,2013,8(1):268-277.

［3］Zhao ZH,Tian Y,Yang JP,et al.RhoC,vascular endothelial growth factor and microvascular density in esophageal squamous cell carcinoma.World J Gastroenterol,2015,21(3):905-912.

［4］卜強,湯華明,談健,等.前列腺癌中RhoC和Rho激酶1的表達及其對絲裂原活化蛋白激酶和Akt蛋白的影響.中華腫瘤雜志,2011,33(3):202-206.

［5］Nieuwenhof HPVD,Avoort IAMVD,Hullu JAD.Review of squamous premalignant vulvar lesions.Critical Reviews in Oncology/hematology,2008,68(2):131-156.

［6］Rolfe KJ,MacLean AB,Crow JC,et al.TP53 mutations in vulval lichen sclerosus adjacent to squamous cell carcinoma of the vulva.Br J Cancer,2003,89(12):2249-2253.

［7］Nowak JM,Grzanka A,Zuryń A,et al.The Rho protein family and its role in the cellular cytoskeleton.Postepy Hig Med Dosw (Online),2008,62(62):110-117.

［8］Matsuoka T,Yashiro M,Kato Y,et al.RhoA/ROCK signaling mediates plasticity of scirrhous gastric carcinoma motility.Clinical & Experimental Metastasis,2011,28(7):627-636.

［9］Matsuoka T,Yashiro M.Rho/ROCK signaling in motility and metastasis of gastric cancer.World J Gastroenterol,2014,20(38): 13756-13766.

［10］Guilluy C,Garcia-Mata R,Burridge K.Rho protein crosstalk: another social network? Trends Cell Biol,2011,21(12):718-726.

［11］Nunes KP,Rigsby CS,Webb RC.RhoA/Rho-kinase and vascular diseases: what is the link? Cell Mol Life Sci,2010,67(22):3823-3836.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.22.010

2016-10-24］

110000 沈陽市婦嬰醫(yī)院(崔丹丹 張麗雅)；中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院(武昕)

武昕