張國(guó)斌

熒光染色法在檢測(cè)痰中結(jié)核桿菌的應(yīng)用分析

張國(guó)斌

目的探討熒光染色法在檢測(cè)痰中結(jié)核桿菌的應(yīng)用價(jià)值。方法80例確診的肺結(jié)核患者,均經(jīng)深咯痰標(biāo)本的收集,制作兩份痰標(biāo)本玻片后分別采用抗酸染色法和免疫熒光法對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè),比較兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)陽(yáng)性率。結(jié)果采用熒光染色法檢測(cè)結(jié)核桿菌的陽(yáng)性率50.0%(40/80)高于抗酸染色法的33.8%(27/80),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。熒光染色法檢測(cè)結(jié)核桿菌+、++、+++、++++的陽(yáng)性率高于抗酸染色法,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論熒光染色法對(duì)結(jié)核分枝桿菌的診斷率較高,而且方便、快捷,對(duì)于肺結(jié)核的診斷具有重要意義。

熒光染色法；痰液；結(jié)核桿菌

結(jié)核病是一種慢性疾病,由結(jié)核桿菌感染所引起,主要通過(guò)呼吸道傳播,屬于人類重大的傳染病之一。21世紀(jì)以來(lái)全球每年約出現(xiàn)800萬(wàn)結(jié)核新病例,約300萬(wàn)人死亡。我國(guó)的結(jié)核病流行情況較為嚴(yán)重,同時(shí)患者的耐結(jié)核藥情況也比較嚴(yán)重。絕大多數(shù)結(jié)核病都是可以治愈的,早期診斷、發(fā)現(xiàn)傳染源對(duì)確定治療方案,改善患者預(yù)后具有積極意義。目前,臨床上對(duì)結(jié)核病的診斷,主要是通過(guò)痰涂片鏡下檢查、病理切片、X線以及細(xì)菌培養(yǎng)等。如何快速有效的檢查分枝桿菌細(xì)菌,發(fā)現(xiàn)傳染源是檢驗(yàn)科值得研究的課題。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道,在常見(jiàn)的幾種結(jié)核病檢測(cè)手段中,熒光染色試驗(yàn)診斷結(jié)核桿菌的陽(yáng)性率較高［1］。本研究選取本院2015年8月～2016年2月收治的80例確診的肺結(jié)核患者為研究對(duì)象,比較熒光染色法與抗酸法的診斷情況,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2015年8月～2016年2月收治的80例確診的肺結(jié)核患者,符合肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］,診斷為活動(dòng)性肺結(jié)核。其中男44例,女36例,年齡21～75歲,平均年齡(45.9±16.2)歲。

1.2方法 收集患者的一般資料,如臨床癥狀、體征、X線、PPD試驗(yàn)、結(jié)核抗體檢查、血常規(guī)、血生化等檢驗(yàn)結(jié)果。每例患者均經(jīng)深咯痰標(biāo)本的收集,制作兩份痰標(biāo)本玻片后分別采用抗酸染色法和免疫熒光法對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)。留取患者清晨痰。用生理鹽水漱口后,以清除口腔內(nèi)的食物殘?jiān)安糠蛛s菌,第一口痰棄去,取深部咳痰三口,合格標(biāo)本量≥1 ml。將收集到的痰液放入無(wú)菌塑料標(biāo)本盒中,勿將唾液或鼻涕吐入標(biāo)本盒。將收集到的痰液放置于無(wú)菌的密封瓶中,檢測(cè)前進(jìn)行相關(guān)處理,將一定劑量的胰酶消化液注入到痰液中,進(jìn)行水浴消化,增強(qiáng)消化效應(yīng)。之后加入一定劑量的氫氧化鈉,采用振蕩器混勻,混合10 min。檢測(cè)時(shí)取處理后的痰液標(biāo)本0.5～0.8 ml,倒入潔凈離心試管中以3000 r/min的速度進(jìn)行離心,時(shí)間為10 min。離心處理后選擇沉淀部分,取0.1 ml置于載玻片中央處,并均勻涂抹成1.0 cm×2.0 cm橢圓形痰膜,薄厚適中,讓其自然干燥后痰涂片火焰固定,置于染色架上。每份痰液制作兩份痰標(biāo)本玻片后分別采用抗酸染色法和免疫熒光法對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)。①熒光染色法：首先經(jīng)制作好的痰涂片放入濕盒中,水洗后用5%的鹽酸乙醇脫色1～2 min,外觀無(wú)黃色為止,水洗。將痰涂片利用熒光素標(biāo)記抗結(jié)核桿菌單克隆抗體對(duì)待檢的標(biāo)本進(jìn)行染色,在LED熒光顯微鏡下,把物鏡焦距調(diào)為40×,對(duì)結(jié)核分枝桿菌的情況進(jìn)行觀察。②抗酸染色法：按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》的常規(guī)操作方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌的情況進(jìn)行檢查,滴加復(fù)紅染色劑后加熱,出現(xiàn)蒸汽后,3～5 min后水洗。然后使用鹽酸乙醇將其脫色,時(shí)間控制在10 min以內(nèi)。脫色后水洗,加亞甲藍(lán)復(fù)染30 s,水洗,室溫下待干。

1.3觀察指標(biāo)及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 比較抗酸染色法和免疫熒光法對(duì)結(jié)核分枝桿菌的診斷陽(yáng)性率。其中抗酸染色標(biāo)本中分枝桿菌呈紅色,其他細(xì)胞核細(xì)菌呈藍(lán)色。20倍熒光顯微鏡下,分枝桿菌呈黃綠色,40倍下可觀察到分枝桿菌呈桿狀或棒狀。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果的不同分為陰性(-)、+、++、+++、++++,兩者均以《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》為準(zhǔn)。熒光染色抗酸桿菌陰性(-)［3］：每50視野符合0條；熒光染色抗酸桿菌陽(yáng)性(+)：每50視野有10～99條；熒光染色抗酸桿菌陽(yáng)性(++)：每個(gè)視野符合1～9條；熒光染色抗酸桿菌陽(yáng)性(+++)：每個(gè)視野符合10～99條；熒光染色抗酸桿菌陽(yáng)性(++++)：每個(gè)視野符合≥100條?？顾釛U菌陰性(-)：連續(xù)觀察300個(gè)不同視野,符合0條/300；抗酸桿菌陽(yáng)性(+)：每100視野符合3～9條；抗酸桿菌陽(yáng)性(++)；每10視野符合1～9條；抗酸桿菌陽(yáng)性(+++)：每視野符合1～9條；抗酸桿菌陽(yáng)性(++++)：每視野符合≥10條。對(duì)兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)陽(yáng)性率進(jìn)行比較。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

采用熒光染色法檢測(cè)結(jié)核桿菌的陽(yáng)性率50.0%(40/80)高于抗酸染色法的33.8%(27/80),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。熒光染色法檢測(cè)結(jié)核桿菌+、++、+++、++++的陽(yáng)性率高于抗酸染色法,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 熒光染色法與抗酸染色法檢測(cè)結(jié)核桿菌的陽(yáng)性率比較［n(%)］

3 討論

肺結(jié)核是一個(gè)全球公共衛(wèi)生和社會(huì)問(wèn)題,其病理基礎(chǔ)不十分清楚,具有病程長(zhǎng)、傳染性強(qiáng)的特點(diǎn)。我國(guó)的肺結(jié)核發(fā)病率于近年來(lái)有逐漸上升的趨勢(shì),面臨著較為嚴(yán)峻的局面。對(duì)疾病的控制首先面臨的問(wèn)題是結(jié)核病的診斷。早期應(yīng)用快捷靈敏的實(shí)驗(yàn)室診斷方法以及發(fā)現(xiàn)和治療肺結(jié)核是該疾病控制的關(guān)鍵。結(jié)核桿菌屬于放線菌目,可侵犯人體的各組織和器官,其中以肺部最為常見(jiàn)［4］。結(jié)核桿菌是肺結(jié)核的致病菌,早在1882年就由德國(guó)細(xì)菌學(xué)家郭霍所證明。結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁中含有較多脂質(zhì),約占細(xì)胞干重的60%。細(xì)胞染色法成為檢測(cè)該種桿菌細(xì)胞的常用方法。抗酸染色法是全世界結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室都在使用的最基本的細(xì)菌學(xué)檢查方法,該方法操作簡(jiǎn)單,但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),而且難以準(zhǔn)確反映痰液當(dāng)中攜帶的細(xì)菌數(shù)目,陽(yáng)性率低,靈敏度和特異性也較差,而且檢測(cè)結(jié)果受標(biāo)本質(zhì)量的影響較大［5］。病理檢測(cè)的準(zhǔn)確性高,但細(xì)菌培養(yǎng)的特異性和敏感性較低,而且耗時(shí)長(zhǎng),在臨床早期應(yīng)用上受到了限制。

隨著結(jié)核病的分子生物學(xué)診斷技術(shù)的迅速發(fā)展,熒光染色法在結(jié)核桿菌的診斷中逐漸推廣起來(lái)。熒光染色法所檢測(cè)的是結(jié)核分枝桿菌的特異DNA片段,熒光顯微鏡下觀察呈現(xiàn)特異性熒光成像,與藍(lán)黑色背景反差很大,對(duì)比鮮明,非常明顯容易被發(fā)現(xiàn)［6］。該方法檢測(cè)既不需要進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng),也不需要菌體是否有活力,具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠、可定量、靈敏度、重復(fù)性和特異性好等特點(diǎn)。而且熒光染色的檢測(cè)結(jié)果在熒光顯微鏡下進(jìn)行,可觀察的范圍更廣,更容易進(jìn)行結(jié)果的判讀。本研究將熒光染色和抗酸染色對(duì)結(jié)核桿菌檢測(cè)的陽(yáng)性率進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),熒光法檢測(cè)的陽(yáng)性率顯著高于抗酸染色,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而且有研究顯示,對(duì)疑似結(jié)核病的患者進(jìn)行熒光染色法檢測(cè)的陽(yáng)性率也高于抗酸染色法［7］,且熒光染色法的檢查靈敏度更高,可為疾病診斷提供較科學(xué)的檢測(cè)依據(jù)。

綜上所述,熒光染色法對(duì)結(jié)核分枝桿菌的診斷率較高,而且方便、快捷,對(duì)于肺結(jié)核的診斷具有重要意義。

［1］張東浩,李影.熒光定量PCR檢測(cè)痰結(jié)核分枝桿菌DNA的應(yīng)用價(jià)值.中國(guó)醫(yī)藥指南,2012,10(1):90-91.

［2］陳文彬,潘祥林.診斷學(xué).第7 版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008: 27.

［3］趙志英,劉振波.不同檢測(cè)方法對(duì)痰液標(biāo)本中結(jié)核桿菌檢測(cè)效果的比較分析.中外健康文摘,2013,10(18):137-138.

［4］丁瑤,葉琴.金胺O熒光染色法應(yīng)用效果評(píng)價(jià).中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng),2015,25(13):151.

［5］張立,周洪經(jīng),馮爽.熒光染色法在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用.山東醫(yī)藥,2014,54(7):55-57.

［6］楊江華,朱曉玥,王文節(jié).免疫熒光染色法檢測(cè)結(jié)核分支桿菌的建立與臨床應(yīng)用.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2015,19(5):775-777.

［7］肖靜,楊元好,金瑛.熒光染色法檢測(cè)痰中結(jié)核桿菌的應(yīng)用.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,35(4):152-153.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.16.008

2016-07-22］

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