喬彥，謝席勝，劉瑞，何明海

(1.南充市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川 南充 637000；2.南充市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 南充 637000；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院人類疾病相關(guān)多肽研究室，四川 成都 610041)

TNFSF4基因rs3850641多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性研究

喬彥1，謝席勝2，劉瑞3，何明海1

(1.南充市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川 南充 637000；2.南充市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 南充 637000；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院人類疾病相關(guān)多肽研究室，四川 成都 610041)

目的 探討四川南充地區(qū)漢族人TNFSF4基因rs3850641多態(tài)性與2型糖尿病(T2DM)的相關(guān)性。方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)檢測(cè)于2014年7月至2015年6月選取的190例正常對(duì)照者和218例T2DM患者(T2DM組)的rs3850641多態(tài)性。葡萄糖氧化酶法測(cè)定兩組受檢者的血糖(Glu)水平，氧化酶法測(cè)定兩組受檢者的血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。結(jié)果TNFSF4基因rs3850641位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律；rs3850641多態(tài)位點(diǎn)G等位基因頻率為0.161；T2DM組和對(duì)照組之間rs3850641位點(diǎn)等位基因的頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[0.163(71/168)vs 0.158 (60/190)，P＞0.05]；對(duì)照組和T2DM組rs3850641位點(diǎn)G基因型攜帶者的血糖水平分別高于各組AA基因型攜帶者的血糖水平[(4.72±1.43)mmol/L vs(4.50±1.30)mmol/L、(6.44±2.45)mmol/L vs(6.23±2.16)mmol/L]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論TNFSF4基因rs3850641多態(tài)性與T2DM無關(guān)聯(lián)，但其G等位基因與血糖水平相關(guān)。

漢族；2型糖尿??；TNFSF4基因；遺傳多態(tài)性；相關(guān)性

糖尿病是威脅人類健康最主要的慢性非傳染性疾病之一，是動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，給全世界社會(huì)及個(gè)體帶來了巨大的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥性疾病。動(dòng)脈內(nèi)膜損傷、斑塊破裂及血栓形成等動(dòng)脈粥樣硬化過程均有炎癥反應(yīng)參與[1-3]。T細(xì)胞的激活是AS的重要炎性因素之一[4]。TNFRSF4及其配體TNFSF4作為免疫應(yīng)答過程中一對(duì)重要的協(xié)同刺激分子，對(duì)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的抗原呈遞功能、促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化具有重要作用，從而影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[5]。經(jīng)證實(shí)，TNFSF4是動(dòng)脈粥樣硬化的易感基因，TNFSF4基因過表達(dá)的小鼠更易出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，而定點(diǎn)敲除TNFSF4基因能顯著減少高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化[6]。有研究證實(shí)糖尿病是一種細(xì)胞免疫性疾病[7-8]，目前尚未見TNFRSF4/TNFSF4這一參與免疫反應(yīng)的信號(hào)通路與2型糖尿病(type 2diabetes mellitus，T2DM)的相關(guān)性研究。本研究旨在探討四川南充地區(qū)漢族人TNFSF4基因rs3850641位點(diǎn)的基因頻率分布及其與T2DM的相關(guān)性，為探討我國(guó)漢族人T2DM的發(fā)病提供分子遺傳學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 (1)T2DM組：選取2014年7月至2015年6月于南充市中心醫(yī)院就診的218例新診斷的2型糖尿病患者，所有患者均符合1999年世界衛(wèi)生組織診斷標(biāo)準(zhǔn)：①糖尿病癥狀(多尿、多飲、多食、體重下降)加隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L；②空腹血糖≥7.0 mmol/L；③葡萄糖負(fù)荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L)，糖尿病病程小于1年，經(jīng)綜合治療后糖化血紅蛋白小于6.5%。其中男性135例，女性83例，平均年齡(51±14)歲。排除1型糖尿病、其他特殊類型糖尿病、妊娠糖尿病、糖尿病急性并發(fā)癥、感染、應(yīng)激、高血壓病、嚴(yán)重高脂血癥及心、肺、肝、腎等主要臟器嚴(yán)重疾患。(2)對(duì)照組：隨機(jī)選取無血緣關(guān)系的健康體檢個(gè)體190例，其中男性121例，女性69例，平均年齡(52±15)歲。經(jīng)詢問病史和體檢，排除心、肺、肝、腎及內(nèi)分泌疾病等。所有受試對(duì)象均為漢族，均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血液基因組DNA的分離及聚合酶鏈反應(yīng) 抽取空腹12～14 h靜脈血1 mL，EDTA抗凝。按Erlich[9]微量DNA全血提取法提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增引物由北京百泰克公司合成。引物1為5'-CACACATTGCTCCGCTATTATT-3'，引物2為5'-AGTCACTGATATACCTGGTCTACCAA-3'。PCR反應(yīng)總體積25 μL，含0.5 μmol/L引物，200 μmol/LdNTP，25mmol/LMgCl2，0.2μgDNA模板，2.0UTaqDNA聚合酶。反應(yīng)在DNA熱循環(huán)儀上進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次；72℃延伸5 min結(jié)束反應(yīng)。用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定 取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入10 U限制性內(nèi)切酶Mun I(Fermentas Biolabs)37℃保溫4 h。酶切產(chǎn)物加入10%聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)樣品槽中，在TBE緩沖液中100 V電壓電泳90 min，EB染色后于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄結(jié)果。

1.2.3 突變序列測(cè)定 隨機(jī)挑選部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。

1.2.4 血脂測(cè)定 按酶法測(cè)定血糖、血清甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)及高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)。低密度脂蛋白膽固醇(1ow density lipoprotein cholesterol，LDL-C)按公式(TG＜4.52 mmol/L)計(jì)算：LDL-C=TC－(TG/2.1+HDL-C)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有資料均用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)描述，組間血糖、血脂比較用t檢驗(yàn)。等位基因和基因型頻率采用基因計(jì)數(shù)法描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)?；蛐蛠喗MAA與AG+GG組間血糖、血脂比較用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組受檢者的臨床及生化資料比較 T2DM組與對(duì)照組年齡與性別構(gòu)成基本一致。與正常對(duì)照組比較，T2DM組患者的血糖、TG、LDL-C水平升高，而HDL-C水平則降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；血清TC和體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組受檢者的臨床及生化資料比較(±s)

表1 兩組受檢者的臨床及生化資料比較(±s)

組別對(duì)照組T2DM組t/χ2值P值例數(shù)190 218年齡(歲) 52.1±14.9 51.4±14.3 0.65 0.57性別(男/女，例) 121/69 136/82 0.07 0.93 BMI(kg/m2) 22.9±2.8 23.1±3.0 0.67 0.51 Glu(mmol/L) 4.64±1.35 6.32±2.45 2.71 0.01 TG(mmol/L) 1.22±0.45 2.19±1.46 2.68 0.01 TC(mmol/L) 5.13±0.71 5.25±0.83 1.62 0.11 HDL-C(mmol/L) 1.42±0.51 0.95±0.46 3.01 0.01 LDL-C(mmol/L) 3.15±0.73 3.26±0.82 2.04 0.04

2.2 TNFSF4基因rs3850641位點(diǎn)的多態(tài)性分析 PCR擴(kuò)增片段大小為188 bp，用限制性內(nèi)切酶MunⅠ消化后，在聚丙烯酰胺凝膠電泳譜上顯示3種基因型：AA純合子存在MunⅠ酶切位點(diǎn)，顯示160 bp和28 bp 2條帶；GG純合子MunⅠ酶切位點(diǎn)消失，顯示188 bp 1條帶；AG雜合子顯示188 bp、160 bp和28 bp 3條帶(圖1)。因28 bp的片段太短，電泳后不能在凝膠上顯示，但不影響基因型的判讀。對(duì)3種基因型進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序圖譜如圖2，箭頭所指處為堿基突變位點(diǎn)，測(cè)序結(jié)果與PCR-RFLP結(jié)果一致。

圖1 rs3850641多態(tài)位點(diǎn)酶切電泳圖

圖2 rs3850641基因多態(tài)性PCR產(chǎn)物測(cè)序圖譜

2.3 兩組受檢者的TNFSF4基因rs3850641基因型及等位基因頻率比較 兩組受檢者的TNFSF4基因rs3850641多態(tài)性基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。由表2可見，rs3850641等位基因分布在兩組均以A等位基因?yàn)槌Ｒ姷任换?，G等位基因?yàn)樯僖姷任换?。rs3850641多態(tài)位點(diǎn)在兩組均以AA基因型最多。rs3850641多態(tài)位點(diǎn)G等位基因頻率為0.161，等位基因A、G的頻率在T2DM組和對(duì)照組分別為0.837、0.163和0.842、0.158。兩組間基因型頻率和等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 TNFSF4基因rs3850641基因型和等位基因頻率分布

2.4 兩組受檢者的TNFSF4基因rs3850641多態(tài)性不同基因型亞組血糖及血脂水平比較 正常對(duì)照組TNFSF4基因rs3850641多態(tài)位點(diǎn)血糖水平在G等位基因攜帶者基因型GG、AG基因型較AA等位基因攜帶者增高(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，T2DM組同樣存在此現(xiàn)象(P＜0.05)。rs3850641多態(tài)位點(diǎn)不同基因亞組TG、TC、HDL-C、LDL-C等血脂指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

表3 兩組受檢者的rs3850641多態(tài)性不同基因型血糖及血脂水平比較(mmol/L，±s)

表3 兩組受檢者的rs3850641多態(tài)性不同基因型血糖及血脂水平比較(mmol/L，±s)

組別 例數(shù)Glu TG TC HDL-C LDL-C對(duì)照組AA AG+GG t值P值T2DM組AA AG+GG t值P值190 4.50±1.30 4.72±1.43a2.12 0.03 1.25±0.37 1.20±0.36 0.53 0.62 5.11±0.67 5.15±0.79 0.30 0.91 1.39±0.50 1.46±0.52 0.45 0.79 3.17±0.61 3.13±0.87 0.38 0.87 218 6.23±2.16 6.44±2.45a2.07 0.04 2.20±1.43 2.18±1.65 0.42 0.72 5.24±0.77 5.27±0.68 0.35 0.89 0.91±0.42 1.01±0.39 0.81 0.42 3.27±0.76 3.24±0.60 0.31 0.92

3 討 論

TNFSF4是腫瘤壞死因子受體，與其配體TNFRSF4結(jié)合后活化，作為T細(xì)胞共刺激分子，參與T細(xì)胞的活化、增殖和遷移[10]。TNFSF4在抗原提呈細(xì)胞、活化的T細(xì)胞及其他包括淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肥大細(xì)胞上表達(dá)。TNFRSF4則在活化的T細(xì)胞上表達(dá)。TNFSF4-TNFRSF4相互作用，影響動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展，已被作為一個(gè)自身免疫性疾病的潛在治療靶點(diǎn)。

TNFSF4是目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)最充分的動(dòng)脈粥樣硬化的易感基因之一。Foks等[11]在LDL受體缺陷的小鼠試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，阻斷TNFSF4/TNFRSF4信號(hào)通路，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的復(fù)發(fā)。有研究表明，TNFSF4/TNFRSF4信號(hào)通路可能是糖尿病患者器官移植保護(hù)的新治療方向[12]。人體研究發(fā)現(xiàn)，rs3850641位點(diǎn)少見的G等位基因與心梗的發(fā)生及冠心病的嚴(yán)重程度相關(guān)[6]。但TNFSF4基因SNP與中國(guó)漢族T2DM的相關(guān)性研究目前罕見報(bào)道。

本研究對(duì)408名漢族人TNFSF4基因rs3850641多態(tài)位點(diǎn)基因型分析顯示，在四川南充地區(qū)漢族人中rs3850641 G等位基因的頻率為0.161，類似于瑞典人群的0.138[6]及美國(guó)人群的0.155[13]，未提示rs3850641基因頻率存在明顯的種族差異性。但是由于地域或種族的差異及樣本構(gòu)成、樣本量大小等因素，可能會(huì)導(dǎo)致研究結(jié)果的不同。T2DM組和對(duì)照組rs3850641位點(diǎn)A、G等位基因頻率分別為0.837、0.163和0.842、0.158，該位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在T2DM組和對(duì)照組之間的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，未提示rs3850641多態(tài)位點(diǎn)與T2DM的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步分析rs3850641多態(tài)性同血脂間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，rs3850641多態(tài)性與血TC、TG、HDL、LDL等血脂水平的無明顯相關(guān)性，提示此位點(diǎn)堿基突變可能不參與血脂代謝，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。但是，在T2DM組和對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)，rs3850641多態(tài)性G等位基因攜帶者血糖水平更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，rs3850641A→G堿基突變可能通過影響血糖水平影響動(dòng)脈粥樣硬化，但目前難以解釋其機(jī)制。我們?cè)趯?duì)照組和T2DM組同時(shí)發(fā)現(xiàn)，rs3850641多態(tài)性G等位基因攜帶者與高水平的血糖關(guān)聯(lián)，故而不能推論這一關(guān)聯(lián)是否對(duì)T2DM的發(fā)生有影響。這種相關(guān)性需要進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)，為解釋rs3850641多態(tài)性對(duì)血糖水平的預(yù)測(cè)價(jià)值提供依據(jù)。

綜上所述，TNFSF4基因rs3850641多態(tài)性與T2DM沒有直接關(guān)聯(lián)，但rs3850641位點(diǎn)G等位基因與四川南充地區(qū)漢族人血糖水平相關(guān)。

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Analysis of TNFSF4 gene rs3850641 polymorphisms in patients with type 2 diabetes mellitus.

QIAO Yan1,XIE Xi-sheng2,LIU Rui3,HE Ming-hai1.1.Department of Endocrinology,Nanchong Central Hospital,Nanchong 637000, Sichuan,CHINA;2.Department of Nephrology,Nanchong Central Hospital,Nanchong 637000,Sichuan,CHINA;3.Division of Peptides-Related Human Diseases,State Key Laboratory of Biotherapy,West China Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan,CHINA

Objective To investigate the variations of TNFSF4 gene rs3850641 polymorphisms and their relationships with type 2 diabetes mellitus(T2DM)among people with Han nationality in Nanchong area of Sichuan Province.MethodsThe genotypes and allele frequencies of rs3850641 polymorphism in 218 T2DM patients and 190 control subjects,who were selected from July 2014 to June 2015,were assayed by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).Serum glucose and lipids of the two groups were measured respectively by glucose oxidase method and oxidase enzymatic kits.ResultsTNFSF4 gene rs3850641 allele and genotype distributions were in Hardy-Weinberg equilibrium.The frequencies of G allele at rs3850641 site were 0.161 in total.There was no significant difference of allele and genotype frequencies between T2DM and control groups,0.163(71/168)vs 0.158(60/190),P＞0.05.Subjects with genotype GG and AG at rs3850641 sites had a significantly higher serum glucose than those with genotype AA in both control and T2DM groups,(4.72±1.43)mmol/L vs(4.5±1.30)mmol/L,(6.44±2.45)mmol/L vs (6.23±2.16)mmol/L,P＜0.05.ConclusionThese results suggest that rs3850641 polymorphism in the TNFSF4 gene may has an effect on serum glucose,but not with type 2 diabetes mellitus in the population group.

Han nationality;Type 2 diabetes mellitus;TNFSF4;Gene polymorphism;Relevance

R587.1

A

1003—6350（2016）20—3276—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.20.003

2016-05-05)

四川省衛(wèi)生廳科研課題(編號(hào)：120283)

謝席勝。E-mail:xishengx@163.com