向樂，唐菀澤，張志珍，馬衛(wèi)列（廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東東莞523808）

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慢病毒介導(dǎo)磷酸二酯酶7A基因沉默細(xì)胞株的構(gòu)建及三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1的表達(dá)變化*

向樂，唐菀澤，張志珍，馬衛(wèi)列
（廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東東莞523808）

摘要：目的利用慢病毒介導(dǎo)構(gòu)建磷酸二酯酶7A（PDE7A）基因沉默人單核巨噬細(xì)胞（THP-1）株，并分析沉默細(xì)胞株的三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）的表達(dá)變化。方法以PDE7A基因?yàn)榘悬c(diǎn)，設(shè)計(jì)合成3 段shRNA片段，與慢病毒載體PmiRzip連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。測序鑒定后進(jìn)行病毒包裝，感染THP-1細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）進(jìn)行分析，確定最佳干擾片段。嘌呤霉素篩選得到PDE7A基因沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。qPCR和Western blot檢測鑒定所構(gòu)建的細(xì)胞株，將其誘導(dǎo)成為泡沫細(xì)胞后鑒定ABCA1基因的表達(dá)。結(jié)果轉(zhuǎn)染shRNA1、shRNA2、shRNA3細(xì)胞的PDE7A相對(duì)表達(dá)量分別為（0.480±0.028）、（0.561±0.016）和（0.377±0.013），故選擇shRNA3作為干擾PDE7A基因的最佳片段。采用1.4 g/L嘌呤霉素成功篩選出PDE7A沉默細(xì)胞株，qPCR和Western blot檢測PDE7A基因的干擾效率，其抑制效率>70%。將其誘導(dǎo)成巨噬泡沫細(xì)胞后，Western blot檢測顯示，ABCA1的表達(dá)量增加40%。結(jié)論成功構(gòu)建PDE7A shRNA慢病毒干擾載體，并篩選出PDE7A基因沉默的THP-1細(xì)胞株，且ABCA1的表達(dá)量增加。

關(guān)鍵詞：磷酸二酯酶7A；RNA干擾；慢病毒；三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1

膽固醇在巨噬細(xì)胞中積累是動(dòng)脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵因素，促進(jìn)細(xì)胞中膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport，RCT）是防治動(dòng)脈粥樣硬化的有效方法[1-2]。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）主要轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇至貧脂的載脂蛋白A-1（apolipoprotein A-1，apoA-1），通過增加高密度脂蛋白來啟動(dòng)RCT，促進(jìn)細(xì)胞中膽固醇外排。

磷酸二酯酶7A（phosphodiesterase 7A，PDE7A）作為環(huán)腺苷一磷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）特異性蛋白水解酶，可降低細(xì)胞中cAMP濃度[3-4]。cAMP作為第二信使，通過cAMP/PKA信號(hào)通路上調(diào)ABCA1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流[5-6]。因此，干擾細(xì)胞PDE7A的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加而上調(diào)ABCA1表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)膽固醇外流。為研究PDE7A在促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流中的作用，需要構(gòu)建合適的細(xì)胞模型。本實(shí)驗(yàn)以人單核巨噬細(xì)胞（human acute monocytic leukemia cell line，THP-1）為研究對(duì)象，通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)構(gòu)建PDE7A基因沉默細(xì)胞株，為后續(xù)研究PDE7A基因功能及巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株與主要試劑

THP-1細(xì)胞購自湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫，HEK-293FT細(xì)胞、HEK-293T細(xì)胞及慢病毒包裝系統(tǒng)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所免疫生物學(xué)室惠贈(zèng)，Lipofectine2000購自美國Life公司，改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco modified eagle medium，DMEM）、洛斯維-1640（roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco公司，嘌呤霉素購自美國Sigma公司，聚凝胺（Polybrene）購自上海翊圣生物科技有限公司，佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）購自美國Promega公司，ac-LDL購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，apoA-1購自美國Sigma公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自北京天根生物公司，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購自大連寶生生物工程有限公司。兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗購自杭州至賢生物公司，兔抗PDE7A一抗購自英國Abcam公司，兔抗ABCA1一抗購自美國Sigma公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司。

1.2方法

1.2.1shRNA設(shè)計(jì)合成根據(jù)GenBank中PDE7A mRNA全序列（NM_002603）及短發(fā)夾RNA（shRNA）設(shè)計(jì)原則，分別設(shè)計(jì)合成3條靶序列和陰性對(duì)照序列的shRNA寡核苷酸單鏈：①5′-GGCCATGCACTG TTACTTAAA-3′；②5′-GAAATAGTCTAGTAAGCTTA A-3′；③5′-GATCGTCACACTGAATCTATT-3′；④NC：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，由上海吉泰生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2慢病毒干擾載體構(gòu)建及慢病毒包裝①慢病毒干擾載體構(gòu)建：將設(shè)計(jì)合成的3條靶序列和陰性對(duì)照序列連接到慢病毒載體Pmi Rzip中，構(gòu)建重組質(zhì)粒PmiRzip-shRNA1、PmiRzip-shRNA2、Pmi RzipshRNA3、Pmi Rzip-shRNA-NC；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為大腸桿菌DH5α，篩選得到單菌落，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒用EcoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)＞3次。將酶切鑒定結(jié)果一致的質(zhì)粒，送上海吉泰生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。②慢病毒包裝：HEK-293FT細(xì)胞鋪10 cm培養(yǎng)皿，37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)至細(xì)胞密度約為85%時(shí)，更換無抗生素、無血清的DMEM培養(yǎng)基。取10.0ml離心管，加入1.5 ml無血清、無雙抗DMEM，按pMD 2.0∶psPAX2∶Pmi Rzip-shRNA=1∶1∶2加入24μg質(zhì)粒進(jìn)行稀釋。取1.5 ml Ep管，各加1.5μl無血清、無雙抗DMEM，加入48μl Lipofectamine 2000，輕輕混勻，靜置5 min；將稀釋的Lipofectamine 2000與稀釋質(zhì)?；靹?，靜置15 min后制備成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將質(zhì)粒與Lipofectamine 2000的復(fù)合物加入培養(yǎng)皿中，輕輕震蕩，使復(fù)合物均勻地分散在細(xì)胞中；37℃、5% CO2培養(yǎng)6 h后更換新鮮無抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，收集病毒，用0.45μm濾器過濾，4℃、4 500裝，置入-80℃冰箱冷凍保存。病毒包裝實(shí)驗(yàn)重復(fù)＞3次。③慢病毒滴度的測定：將HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，經(jīng)胰酶消化后，按8×103個(gè)細(xì)胞/孔，接種96孔板，待細(xì)胞長至30%～50%密度時(shí)，更換含病毒的完全培養(yǎng)基，病毒用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋。48 h后去除含慢病毒的培養(yǎng)基，加入100μl完全培養(yǎng)基。96 h后在熒光顯微鏡下觀察各孔熒光細(xì)胞數(shù)，病毒滴度為表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

1.2.3慢病毒shRNA干擾效果鑒定接種THP-1細(xì)胞于24孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，加入聚凝胺（Polybrene）至濃度8 g/L。12 h后用RPMI 1640完全培養(yǎng)基將病毒濃縮液稀釋5倍，加入Polybrene至濃度8 g/L，棄24孔板的培養(yǎng)基，加入含病毒的RPMI 1640完全培養(yǎng)基。24 h后更換新鮮RPMI 1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）鑒定最佳干擾片段。

1.2.4沉默細(xì)胞株的構(gòu)建①嘌呤霉素最佳濃度確定：將THP-1細(xì)胞接種至24孔板，1×105個(gè)細(xì)胞/孔，置37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 g/L嘌呤霉素對(duì)正常THP-1細(xì)胞進(jìn)行篩選預(yù)實(shí)驗(yàn)，14 d后觀察細(xì)胞全部死亡的最小濃度作為最佳篩選濃度。②建立PDE7A沉默細(xì)胞株：接種THP-1細(xì)胞至6孔板，2×106個(gè)細(xì)胞/孔，加入Polybrene至濃度8g/L。12h后用RPMI 1640完全培養(yǎng)基將最佳干擾片段shRNA3病毒上清液稀釋5倍，加入Polybrene至濃度8 g/L，棄6孔板的培養(yǎng)基，加入含病毒的RPMI 1640完全培養(yǎng)基。24 h后更換新鮮RPMI 1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后用0.4 g/L嘌呤霉素RPMI 1640完全培養(yǎng)基篩選細(xì)胞，正常THP-1細(xì)胞做對(duì)照組，逐漸增加嘌呤霉素的濃度至最佳篩選濃度1.4 g/L，直至無細(xì)胞死亡。連續(xù)培養(yǎng)50代后，采用qPCR和Western blot檢測鑒定PDE7A的表達(dá)。

1.2.5PDE7A沉默細(xì)胞株的鑒定①PDE7A基因沉默細(xì)胞株的qPCR鑒定：分別取THP-1細(xì)胞、PDE7A沉默的THP-1細(xì)胞和shRNA-NC-THP-1細(xì)胞，按RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行提取各細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，使用Light Cycler@96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測THP-1細(xì)胞和各組THP-1基因沉默細(xì)胞PDE7A基因的相對(duì)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。②PDE7A蛋白表達(dá)分析，分別取THP-1細(xì)胞、PDE7A沉默的THP-1細(xì)胞和shRNA-NC-THP-1細(xì)胞，800 r/min離心5 min去培養(yǎng)基，加入細(xì)胞裂解液置冰上裂解40 min；12 000 r/min離心10 min；加入5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液，沸水浴中變性5 min；進(jìn)行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉2 h；分別用PDE7A和GAPDH抗體4℃孵育過夜；TBST緩沖液（tris buffered saline with tween-20，TBST）洗膜5次，每次5 min，加入二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜5次，每次5 min，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）化學(xué)發(fā)光試劑后進(jìn)行成像，并用蛋白灰度分析軟件分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6Western blot檢測PDE7A沉默的巨噬泡沫細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)取6孔板，1.5×106個(gè)細(xì)胞/孔，實(shí)驗(yàn)分4組。第1、2組接種THP-1細(xì)胞；第3組接種shRNA-NC-THP-1細(xì)胞，第4組接種PDE7A沉默的THP-1細(xì)胞。加入PMA至終濃度160 nmol/L，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，使懸浮細(xì)胞分化為貼壁巨噬細(xì)胞。加入含0.2%BSA和37.5 g/LAc-LDL的1640完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，使巨噬細(xì)胞變?yōu)榕菽?xì)胞。加入含10 g/L apoA-1的1640完全培養(yǎng)基，12 h提取蛋白，Western blot檢測分析泡沫細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差（Oneway，ANOVA）分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1慢病毒干擾載體的構(gòu)建

根據(jù)PDE7A的基因序列設(shè)計(jì)3段寡核苷酸片段，構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒，用EcoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定（見圖1）。將陽性重組質(zhì)粒測序，證實(shí)插入的核酸序列與前期設(shè)計(jì)完全一致（見圖2），提示PDE7A基因shRNA慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2慢病毒包裝

如圖3所示，按pMD2.0∶psPAX2∶Pmi RzipshRNA=1∶1∶2共轉(zhuǎn)染HEK-293FT細(xì)胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)6 h，更換新鮮無抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染有效率＞90%。

圖1　慢病毒重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.3慢病毒滴度測定

圖2　慢病毒重組質(zhì)粒測序圖譜

將HEK-293T細(xì)胞按8×103個(gè)細(xì)胞/孔，接種96孔板，待細(xì)胞長至30%～50%的密度時(shí)，更換含病毒的完全培養(yǎng)基，病毒用含有10% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液梯度稀釋至1×10-2～1×10-8。48 h后去除含慢病毒的培養(yǎng)基，加入100μl完全培養(yǎng)基。96 h后在熒光顯微鏡下觀察各孔熒光細(xì)胞數(shù)，病毒滴度為1×108TU/ml。見圖4。

圖3　共轉(zhuǎn)染48 h后HEK-293FT細(xì)胞熒光顯微鏡觀察結(jié)果（×100）

2.4shRNA片段的干擾效果分析

3個(gè)干擾片段和陰性對(duì)照組病毒稀釋液感染THP-1細(xì)胞，72 h后熒光顯微鏡下觀察，感染有效率達(dá)90%（見圖5）。通過qPCR分析，感染shRNA1、shRNA2和shRNA3片段慢病毒細(xì)胞的PDE7A相對(duì)表達(dá)量分別為（0.480±0.028）、（0.561±0.016）和（0.377±0.013），提示shRNA3片段對(duì)PDE7A干擾效果較好，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇shRNA3片段作為干擾片段。

圖4　病毒稀釋液感染HEK-293T細(xì)胞的熒光圖（×100）

圖5　慢病毒感染THP-1細(xì)胞72h后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果（×100）

2.5嘌呤霉素最佳濃度確定

本實(shí)驗(yàn)分別用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 g/L嘌呤霉素對(duì)正常THP-1細(xì)胞進(jìn)行篩選，14 d 后0.4 g/L少部分細(xì)胞死亡，0.8 g/L大部分細(xì)胞死亡，1.4 g/L細(xì)胞幾乎全部死亡，故確定嘌呤霉素最佳濃度為1.4 g/L。

2.6PDE7A沉默細(xì)胞株的鑒定

連續(xù)培養(yǎng)50代后，qPCR結(jié)果表明，shRNA- NC-THP-1和shRNA3- THP-1細(xì)胞中PDE7A mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（0.859±0.016）和（0.293±0.032），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）（見圖6和表1）。Western blot檢測THP-1細(xì)胞、shRNA- NC-THP-1和shRNA3- THP-1細(xì)胞中PDE7A蛋白表達(dá)（見圖7和表2）。蛋白灰度分析軟件分析表明，shRNA3-THP-1細(xì)胞中PDE7A蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.153±0.025），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。

圖6　PDE7A mRNA相對(duì)表達(dá)水平

圖7　PDE7A蛋白相對(duì)表達(dá)水平

表2　PDE7A蛋白在THP-1、shRNA-NC-THP-1 和shRNA3-THP-1的相對(duì)表達(dá)水平方差分析

2.7PDE7A沉默的巨噬泡沫細(xì)胞中ABCA1蛋白相對(duì)表達(dá)水平

Western blot檢測巨噬泡沫細(xì)胞各組中ABCA1的相對(duì)表達(dá)量（見圖8和表3），與apoA-1處理組比較，shRNA3處理組ABCA1蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.400±0.023），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。

表3　不同處理組的ABCA1蛋白相對(duì)表達(dá)水平的方差分析

圖8　不同處理組ABCA1蛋白的相對(duì)表達(dá)量

3　討論

cAMP作為第二信使在細(xì)胞內(nèi)有重要作用，當(dāng)其含量變化時(shí)會(huì)使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路、細(xì)胞的增殖及新陳代謝等生理活動(dòng)受影響。細(xì)胞內(nèi)cAMP含量受腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）和磷酸二酯酶（phosphodiesteras，PDEs）的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，通過專一性抑制PDEs活性，可減少細(xì)胞內(nèi)cAMP降解，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)過量膽固醇流出，PDEs抑制劑用于抗動(dòng)脈粥樣硬化形成受到關(guān)注[7]。細(xì)胞內(nèi)cAMP特異性PDEs主要為PDE4和PDE7[8]。臨床上，現(xiàn)有的PDE4抑制劑有明顯的副作用，如嘔吐、痙攣[9]，所以需要尋找新的PDEs抑制劑。PDE7家族有兩種亞型即PDE7A和磷酸二酯酶7B（phosphodiestera 7B，PDE7B），主要分布在免疫和炎癥細(xì)胞中，已有多種合成抑制劑[10]。PDE7B廣泛分布于人體不同組織器官，而PDE7A則局限于心臟等器官，且PDE7A表達(dá)水平比PDE7B高出約10倍，通過cAMP/PKA通路調(diào)節(jié)ABCA1介導(dǎo)的膽固醇流出，可作為新的心血管疾病治療靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)選擇人單核THP-1細(xì)胞作為靶細(xì)胞，針對(duì)PDE7A基因設(shè)計(jì)干擾片段，與慢病毒載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提后，電泳與基因測序鑒定慢病毒PDE7A干擾載體構(gòu)建成功。PDE7A慢病毒干擾載體與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293FT，熒光顯微鏡下觀察到大量綠色熒光蛋白表達(dá)，顯示慢病毒成功包裝。慢病毒感染THP-1細(xì)胞后經(jīng)嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定的干擾細(xì)胞株，qPCR和Western blot檢測證實(shí)PDE7A的干擾效率可達(dá)70%。ABCA1作為主要體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)體將細(xì)胞內(nèi)膽固醇排出至apoA-1，是高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）顆粒形成的關(guān)鍵過程。apoA-1與ABCA1結(jié)合后促進(jìn)細(xì)胞膽固醇流出，促使貧脂的apoA-1形成富含膽固醇的HDL進(jìn)入RCT循環(huán)[11-13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，apoA-1處理組比Ac-LDL處理組的ABCA1表達(dá)量升高，提示apoA-1可通過提高ABCA1表達(dá)，增強(qiáng)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出，shRNA3-apoA-1處理組的ABCA1表達(dá)量比apoA-1處理組增加40%，說明干擾后PDE7A基因的ABCA1表達(dá)量增加。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究PDE7A在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為發(fā)現(xiàn)新的治療心血管疾病藥物提供潛在靶點(diǎn)。

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（童穎丹編輯）

Construction of PDE7A gene silencing THP-1 cell lines by lentivirus-mediated RNA interference and expression of ABCA1*

Le Xiang, Wan-ze Tang, Zhi-zhen Zhang, Wei-lie Ma
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Guangdong Medical College, Dongguan, Guangdong 523808, China)

Abstract:Objective To construct phosphodiesterase 7A (PDE7A) gene silence human acute monocytic leukemia (THP-1) cell lines by lentivirus-mediated RNA interference technique, and to analyze the expression of ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) in THP-1 cell lines. Methods Three human PDE7A gene targeted shRNA fragments (shRNA1, shRNA2 and shRNA3) and shRNA-NC fragment were designed and synthesized, then connected with lentiviral vector PmiRzip to construct recombinant plasmids. After DNA sequencing, the lentivirus was packaged, and infected the THP-1 cells. The inhibitory effect of PDE7A shRNAs was analyzed by qPCR. Subsequently, the THP-1 cells were screened with Puromycin to get stable PDE7A gene silencing cell lines which were then identified by qPCR and Western blot. The expression of ABCA1 was determined after THP-1 cells were induced to develop macrophage foam cells. Results The relative expression of PDE7A in the cells transfected with shRNA1, shRNA2 or shRNA3 was (0.480±0.028), (0.561±0.016) and (0.377±0.013) respectively; then shRNA3 was chosen as interferent PDE7A gene fragment. PDE7A silence cell lines were successfully screened with 1.4 g/L Puromycin. PDE7A gene interference efficiency was identified by qPCR and Western blot, and inhibition efficiency was more than 70%. The expression of ABCA1 wasbook=2,ebook=8increased by more than 40% after THP-1 cells were induced into macrophage foam cells. Conclusions PDE7A silencing lentivirus interference vector has been successfully constructed, and PDE7A gene silencing THP-1 cell lines have been screened out in which ABCA1 expression is increased.

Keywords:phosphodiesterase 7A; RNA interference; lentivirus; ATP-binding cassette transporter A1

通信作者]馬衛(wèi)列，E-mail：mazhangwu@163.com

*基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（No：81170267）；廣東省高等學(xué)校人才引進(jìn)專項(xiàng)[No：粵財(cái)教（2013）246號(hào)][

收稿日期：2015-10-14

文章編號(hào)：1005-8982（2016）03-0001-08

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.03.001

中圖分類號(hào)：R341

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A