向樂,唐菀澤,張志珍,馬衛(wèi)列(廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,廣東東莞523808)
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慢病毒介導(dǎo)磷酸二酯酶7A基因沉默細(xì)胞株的構(gòu)建及三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1的表達(dá)變化*
向樂,唐菀澤,張志珍,馬衛(wèi)列
(廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,廣東東莞523808)
摘要:目的利用慢病毒介導(dǎo)構(gòu)建磷酸二酯酶7A(PDE7A)基因沉默人單核巨噬細(xì)胞(THP-1)株,并分析沉默細(xì)胞株的三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)的表達(dá)變化。方法以PDE7A基因?yàn)榘悬c(diǎn),設(shè)計(jì)合成3 段shRNA片段,與慢病毒載體PmiRzip連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒。測序鑒定后進(jìn)行病毒包裝,感染THP-1細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)進(jìn)行分析,確定最佳干擾片段。嘌呤霉素篩選得到PDE7A基因沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。qPCR和Western blot檢測鑒定所構(gòu)建的細(xì)胞株,將其誘導(dǎo)成為泡沫細(xì)胞后鑒定ABCA1基因的表達(dá)。結(jié)果轉(zhuǎn)染shRNA1、shRNA2、shRNA3細(xì)胞的PDE7A相對(duì)表達(dá)量分別為(0.480±0.028)、(0.561±0.016)和(0.377±0.013),故選擇shRNA3作為干擾PDE7A基因的最佳片段。采用1.4 g/L嘌呤霉素成功篩選出PDE7A沉默細(xì)胞株,qPCR和Western blot檢測PDE7A基因的干擾效率,其抑制效率>70%。將其誘導(dǎo)成巨噬泡沫細(xì)胞后,Western blot檢測顯示,ABCA1的表達(dá)量增加40%。結(jié)論成功構(gòu)建PDE7A shRNA慢病毒干擾載體,并篩選出PDE7A基因沉默的THP-1細(xì)胞株,且ABCA1的表達(dá)量增加。
關(guān)鍵詞:磷酸二酯酶7A;RNA干擾;慢病毒;三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1
膽固醇在巨噬細(xì)胞中積累是動(dòng)脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵因素,促進(jìn)細(xì)胞中膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport,RCT)是防治動(dòng)脈粥樣硬化的有效方法[1-2]。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)主要轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇至貧脂的載脂蛋白A-1(apolipoprotein A-1,apoA-1),通過增加高密度脂蛋白來啟動(dòng)RCT,促進(jìn)細(xì)胞中膽固醇外排。
磷酸二酯酶7A(phosphodiesterase 7A,PDE7A)作為環(huán)腺苷一磷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)特異性蛋白水解酶,可降低細(xì)胞中cAMP濃度[3-4]。cAMP作為第二信使,通過cAMP/PKA信號(hào)通路上調(diào)ABCA1表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流[5-6]。因此,干擾細(xì)胞PDE7A的表達(dá),使細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加而上調(diào)ABCA1表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)膽固醇外流。為研究PDE7A在促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流中的作用,需要構(gòu)建合適的細(xì)胞模型。本實(shí)驗(yàn)以人單核巨噬細(xì)胞(human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)為研究對(duì)象,通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)構(gòu)建PDE7A基因沉默細(xì)胞株,為后續(xù)研究PDE7A基因功能及巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
1.1細(xì)胞株與主要試劑
THP-1細(xì)胞購自湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫,HEK-293FT細(xì)胞、HEK-293T細(xì)胞及慢病毒包裝系統(tǒng)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所免疫生物學(xué)室惠贈(zèng),Lipofectine2000購自美國Life公司,改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco modified eagle medium,DMEM)、洛斯維-1640(roswell park memorial institute 1640,RPMI 1640)培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司,嘌呤霉素購自美國Sigma公司,聚凝胺(Polybrene)購自上海翊圣生物科技有限公司,佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)購自美國Promega公司,ac-LDL購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司,apoA-1購自美國Sigma公司,無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自北京天根生物公司,熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒購自大連寶生生物工程有限公司。兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗購自杭州至賢生物公司,兔抗PDE7A一抗購自英國Abcam公司,兔抗ABCA1一抗購自美國Sigma公司,辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司。
1.2方法
1.2.1shRNA設(shè)計(jì)合成根據(jù)GenBank中PDE7A mRNA全序列(NM_002603)及短發(fā)夾RNA(shRNA)設(shè)計(jì)原則,分別設(shè)計(jì)合成3條靶序列和陰性對(duì)照序列的shRNA寡核苷酸單鏈:①5′-GGCCATGCACTG TTACTTAAA-3′;②5′-GAAATAGTCTAGTAAGCTTA A-3′;③5′-GATCGTCACACTGAATCTATT-3′;④NC:5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′,由上海吉泰生物技術(shù)有限公司合成。
1.2.2慢病毒干擾載體構(gòu)建及慢病毒包裝①慢病毒干擾載體構(gòu)建:將設(shè)計(jì)合成的3條靶序列和陰性對(duì)照序列連接到慢病毒載體Pmi Rzip中,構(gòu)建重組質(zhì)粒PmiRzip-shRNA1、PmiRzip-shRNA2、Pmi RzipshRNA3、Pmi Rzip-shRNA-NC;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為大腸桿菌DH5α,篩選得到單菌落,挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒用EcoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定,實(shí)驗(yàn)重復(fù)>3次。將酶切鑒定結(jié)果一致的質(zhì)粒,送上海吉泰生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。②慢病毒包裝:HEK-293FT細(xì)胞鋪10 cm培養(yǎng)皿,37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)至細(xì)胞密度約為85%時(shí),更換無抗生素、無血清的DMEM培養(yǎng)基。取10.0ml離心管,加入1.5 ml無血清、無雙抗DMEM,按pMD 2.0∶psPAX2∶Pmi Rzip-shRNA=1∶1∶2加入24μg質(zhì)粒進(jìn)行稀釋。取1.5 ml Ep管,各加1.5μl無血清、無雙抗DMEM,加入48μl Lipofectamine 2000,輕輕混勻,靜置5 min;將稀釋的Lipofectamine 2000與稀釋質(zhì)?;靹?,靜置15 min后制備成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將質(zhì)粒與Lipofectamine 2000的復(fù)合物加入培養(yǎng)皿中,輕輕震蕩,使復(fù)合物均勻地分散在細(xì)胞中;37℃、5% CO2培養(yǎng)6 h后更換新鮮無抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,收集病毒,用0.45μm濾器過濾,4℃、4 500裝,置入-80℃冰箱冷凍保存。病毒包裝實(shí)驗(yàn)重復(fù)>3次。③慢病毒滴度的測定:將HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,經(jīng)胰酶消化后,按8×103個(gè)細(xì)胞/孔,接種96孔板,待細(xì)胞長至30%~50%密度時(shí),更換含病毒的完全培養(yǎng)基,病毒用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋。48 h后去除含慢病毒的培養(yǎng)基,加入100μl完全培養(yǎng)基。96 h后在熒光顯微鏡下觀察各孔熒光細(xì)胞數(shù),病毒滴度為表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
1.2.3慢病毒shRNA干擾效果鑒定接種THP-1細(xì)胞于24孔板,每孔1×105個(gè)細(xì)胞,加入聚凝胺(Polybrene)至濃度8 g/L。12 h后用RPMI 1640完全培養(yǎng)基將病毒濃縮液稀釋5倍,加入Polybrene至濃度8 g/L,棄24孔板的培養(yǎng)基,加入含病毒的RPMI 1640完全培養(yǎng)基。24 h后更換新鮮RPMI 1640完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)72 h后實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR)鑒定最佳干擾片段。
1.2.4沉默細(xì)胞株的構(gòu)建①嘌呤霉素最佳濃度確定:將THP-1細(xì)胞接種至24孔板,1×105個(gè)細(xì)胞/孔,置37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 g/L嘌呤霉素對(duì)正常THP-1細(xì)胞進(jìn)行篩選預(yù)實(shí)驗(yàn),14 d后觀察細(xì)胞全部死亡的最小濃度作為最佳篩選濃度。②建立PDE7A沉默細(xì)胞株:接種THP-1細(xì)胞至6孔板,2×106個(gè)細(xì)胞/孔,加入Polybrene至濃度8g/L。12h后用RPMI 1640完全培養(yǎng)基將最佳干擾片段shRNA3病毒上清液稀釋5倍,加入Polybrene至濃度8 g/L,棄6孔板的培養(yǎng)基,加入含病毒的RPMI 1640完全培養(yǎng)基。24 h后更換新鮮RPMI 1640完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h后用0.4 g/L嘌呤霉素RPMI 1640完全培養(yǎng)基篩選細(xì)胞,正常THP-1細(xì)胞做對(duì)照組,逐漸增加嘌呤霉素的濃度至最佳篩選濃度1.4 g/L,直至無細(xì)胞死亡。連續(xù)培養(yǎng)50代后,采用qPCR和Western blot檢測鑒定PDE7A的表達(dá)。
1.2.5PDE7A沉默細(xì)胞株的鑒定①PDE7A基因沉默細(xì)胞株的qPCR鑒定:分別取THP-1細(xì)胞、PDE7A沉默的THP-1細(xì)胞和shRNA-NC-THP-1細(xì)胞,按RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行提取各細(xì)胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參,使用Light Cycler@96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測THP-1細(xì)胞和各組THP-1基因沉默細(xì)胞PDE7A基因的相對(duì)表達(dá),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。②PDE7A蛋白表達(dá)分析,分別取THP-1細(xì)胞、PDE7A沉默的THP-1細(xì)胞和shRNA-NC-THP-1細(xì)胞,800 r/min離心5 min去培養(yǎng)基,加入細(xì)胞裂解液置冰上裂解40 min;12 000 r/min離心10 min;加入5×十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)上樣緩沖液,沸水浴中變性5 min;進(jìn)行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,5%牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)封閉2 h;分別用PDE7A和GAPDH抗體4℃孵育過夜;TBST緩沖液(tris buffered saline with tween-20,TBST)洗膜5次,每次5 min,加入二抗,室溫孵育2 h,TBST洗膜5次,每次5 min,加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence,ECL)化學(xué)發(fā)光試劑后進(jìn)行成像,并用蛋白灰度分析軟件分析結(jié)果,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.6Western blot檢測PDE7A沉默的巨噬泡沫細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)取6孔板,1.5×106個(gè)細(xì)胞/孔,實(shí)驗(yàn)分4組。第1、2組接種THP-1細(xì)胞;第3組接種shRNA-NC-THP-1細(xì)胞,第4組接種PDE7A沉默的THP-1細(xì)胞。加入PMA至終濃度160 nmol/L,37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h,使懸浮細(xì)胞分化為貼壁巨噬細(xì)胞。加入含0.2%BSA和37.5 g/LAc-LDL的1640完全培養(yǎng)基,37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h,使巨噬細(xì)胞變?yōu)榕菽?xì)胞。加入含10 g/L apoA-1的1640完全培養(yǎng)基,12 h提取蛋白,Western blot檢測分析泡沫細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,用單因素方差(Oneway,ANOVA)分析,兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1慢病毒干擾載體的構(gòu)建
根據(jù)PDE7A的基因序列設(shè)計(jì)3段寡核苷酸片段,構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒,用EcoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定(見圖1)。將陽性重組質(zhì)粒測序,證實(shí)插入的核酸序列與前期設(shè)計(jì)完全一致(見圖2),提示PDE7A基因shRNA慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。
2.2慢病毒包裝
如圖3所示,按pMD2.0∶psPAX2∶Pmi RzipshRNA=1∶1∶2共轉(zhuǎn)染HEK-293FT細(xì)胞,37℃、5% CO2培養(yǎng)6 h,更換新鮮無抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染有效率>90%。
圖1 慢病毒重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定
2.3慢病毒滴度測定
圖2 慢病毒重組質(zhì)粒測序圖譜
將HEK-293T細(xì)胞按8×103個(gè)細(xì)胞/孔,接種96孔板,待細(xì)胞長至30%~50%的密度時(shí),更換含病毒的完全培養(yǎng)基,病毒用含有10% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液梯度稀釋至1×10-2~1×10-8。48 h后去除含慢病毒的培養(yǎng)基,加入100μl完全培養(yǎng)基。96 h后在熒光顯微鏡下觀察各孔熒光細(xì)胞數(shù),病毒滴度為1×108TU/ml。見圖4。
圖3 共轉(zhuǎn)染48 h后HEK-293FT細(xì)胞熒光顯微鏡觀察結(jié)果(×100)
2.4shRNA片段的干擾效果分析
3個(gè)干擾片段和陰性對(duì)照組病毒稀釋液感染THP-1細(xì)胞,72 h后熒光顯微鏡下觀察,感染有效率達(dá)90%(見圖5)。通過qPCR分析,感染shRNA1、shRNA2和shRNA3片段慢病毒細(xì)胞的PDE7A相對(duì)表達(dá)量分別為(0.480±0.028)、(0.561±0.016)和(0.377±0.013),提示shRNA3片段對(duì)PDE7A干擾效果較好,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇shRNA3片段作為干擾片段。
圖4 病毒稀釋液感染HEK-293T細(xì)胞的熒光圖(×100)
圖5 慢病毒感染THP-1細(xì)胞72h后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果(×100)
2.5嘌呤霉素最佳濃度確定
本實(shí)驗(yàn)分別用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 g/L嘌呤霉素對(duì)正常THP-1細(xì)胞進(jìn)行篩選,14 d 后0.4 g/L少部分細(xì)胞死亡,0.8 g/L大部分細(xì)胞死亡,1.4 g/L細(xì)胞幾乎全部死亡,故確定嘌呤霉素最佳濃度為1.4 g/L。
2.6PDE7A沉默細(xì)胞株的鑒定
連續(xù)培養(yǎng)50代后,qPCR結(jié)果表明,shRNA- NC-THP-1和shRNA3- THP-1細(xì)胞中PDE7A mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(0.859±0.016)和(0.293±0.032),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)(見圖6和表1)。Western blot檢測THP-1細(xì)胞、shRNA- NC-THP-1和shRNA3- THP-1細(xì)胞中PDE7A蛋白表達(dá)(見圖7和表2)。蛋白灰度分析軟件分析表明,shRNA3-THP-1細(xì)胞中PDE7A蛋白的相對(duì)表達(dá)量為(0.153±0.025),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
圖6 PDE7A mRNA相對(duì)表達(dá)水平
圖7 PDE7A蛋白相對(duì)表達(dá)水平
表2 PDE7A蛋白在THP-1、shRNA-NC-THP-1 和shRNA3-THP-1的相對(duì)表達(dá)水平方差分析
2.7PDE7A沉默的巨噬泡沫細(xì)胞中ABCA1蛋白相對(duì)表達(dá)水平
Western blot檢測巨噬泡沫細(xì)胞各組中ABCA1的相對(duì)表達(dá)量(見圖8和表3),與apoA-1處理組比較,shRNA3處理組ABCA1蛋白相對(duì)表達(dá)量為(1.400±0.023),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
表3 不同處理組的ABCA1蛋白相對(duì)表達(dá)水平的方差分析
圖8 不同處理組ABCA1蛋白的相對(duì)表達(dá)量
cAMP作為第二信使在細(xì)胞內(nèi)有重要作用,當(dāng)其含量變化時(shí)會(huì)使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路、細(xì)胞的增殖及新陳代謝等生理活動(dòng)受影響。細(xì)胞內(nèi)cAMP含量受腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)和磷酸二酯酶(phosphodiesteras,PDEs)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié),通過專一性抑制PDEs活性,可減少細(xì)胞內(nèi)cAMP降解,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)過量膽固醇流出,PDEs抑制劑用于抗動(dòng)脈粥樣硬化形成受到關(guān)注[7]。細(xì)胞內(nèi)cAMP特異性PDEs主要為PDE4和PDE7[8]。臨床上,現(xiàn)有的PDE4抑制劑有明顯的副作用,如嘔吐、痙攣[9],所以需要尋找新的PDEs抑制劑。PDE7家族有兩種亞型即PDE7A和磷酸二酯酶7B(phosphodiestera 7B,PDE7B),主要分布在免疫和炎癥細(xì)胞中,已有多種合成抑制劑[10]。PDE7B廣泛分布于人體不同組織器官,而PDE7A則局限于心臟等器官,且PDE7A表達(dá)水平比PDE7B高出約10倍,通過cAMP/PKA通路調(diào)節(jié)ABCA1介導(dǎo)的膽固醇流出,可作為新的心血管疾病治療靶點(diǎn)。
本實(shí)驗(yàn)選擇人單核THP-1細(xì)胞作為靶細(xì)胞,針對(duì)PDE7A基因設(shè)計(jì)干擾片段,與慢病毒載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒,經(jīng)轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提后,電泳與基因測序鑒定慢病毒PDE7A干擾載體構(gòu)建成功。PDE7A慢病毒干擾載體與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293FT,熒光顯微鏡下觀察到大量綠色熒光蛋白表達(dá),顯示慢病毒成功包裝。慢病毒感染THP-1細(xì)胞后經(jīng)嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定的干擾細(xì)胞株,qPCR和Western blot檢測證實(shí)PDE7A的干擾效率可達(dá)70%。ABCA1作為主要體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)體將細(xì)胞內(nèi)膽固醇排出至apoA-1,是高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)顆粒形成的關(guān)鍵過程。apoA-1與ABCA1結(jié)合后促進(jìn)細(xì)胞膽固醇流出,促使貧脂的apoA-1形成富含膽固醇的HDL進(jìn)入RCT循環(huán)[11-13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,apoA-1處理組比Ac-LDL處理組的ABCA1表達(dá)量升高,提示apoA-1可通過提高ABCA1表達(dá),增強(qiáng)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出,shRNA3-apoA-1處理組的ABCA1表達(dá)量比apoA-1處理組增加40%,說明干擾后PDE7A基因的ABCA1表達(dá)量增加。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究PDE7A在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),同時(shí)也為發(fā)現(xiàn)新的治療心血管疾病藥物提供潛在靶點(diǎn)。
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(童穎丹編輯)
Construction of PDE7A gene silencing THP-1 cell lines by lentivirus-mediated RNA interference and expression of ABCA1*
Le Xiang, Wan-ze Tang, Zhi-zhen Zhang, Wei-lie Ma
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Guangdong Medical College, Dongguan, Guangdong 523808, China)
Abstract:Objective To construct phosphodiesterase 7A (PDE7A) gene silence human acute monocytic leukemia (THP-1) cell lines by lentivirus-mediated RNA interference technique, and to analyze the expression of ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) in THP-1 cell lines. Methods Three human PDE7A gene targeted shRNA fragments (shRNA1, shRNA2 and shRNA3) and shRNA-NC fragment were designed and synthesized, then connected with lentiviral vector PmiRzip to construct recombinant plasmids. After DNA sequencing, the lentivirus was packaged, and infected the THP-1 cells. The inhibitory effect of PDE7A shRNAs was analyzed by qPCR. Subsequently, the THP-1 cells were screened with Puromycin to get stable PDE7A gene silencing cell lines which were then identified by qPCR and Western blot. The expression of ABCA1 was determined after THP-1 cells were induced to develop macrophage foam cells. Results The relative expression of PDE7A in the cells transfected with shRNA1, shRNA2 or shRNA3 was (0.480±0.028), (0.561±0.016) and (0.377±0.013) respectively; then shRNA3 was chosen as interferent PDE7A gene fragment. PDE7A silence cell lines were successfully screened with 1.4 g/L Puromycin. PDE7A gene interference efficiency was identified by qPCR and Western blot, and inhibition efficiency was more than 70%. The expression of ABCA1 wasbook=2,ebook=8increased by more than 40% after THP-1 cells were induced into macrophage foam cells. Conclusions PDE7A silencing lentivirus interference vector has been successfully constructed, and PDE7A gene silencing THP-1 cell lines have been screened out in which ABCA1 expression is increased.
Keywords:phosphodiesterase 7A; RNA interference; lentivirus; ATP-binding cassette transporter A1
通信作者]馬衛(wèi)列,E-mail:mazhangwu@163.com
*基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(No:81170267);廣東省高等學(xué)校人才引進(jìn)專項(xiàng)[No:粵財(cái)教(2013)246號(hào)][
收稿日期:2015-10-14
文章編號(hào):1005-8982(2016)03-0001-08
DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.03.001
中圖分類號(hào):R341
文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A