王衛(wèi)芳，柳瀟，計曉玲，楊波

· 論著 ·

TNF-α抑制劑通過激活Notch1信號通路治療創(chuàng)傷后心肌再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究

王衛(wèi)芳1，柳瀟1，計曉玲1，楊波1

目的探討腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抑制劑（依那西普）通過跨膜蛋白受體Notch1信號通路對小鼠創(chuàng)傷性心肌損傷的保護(hù)作用。方法選取c57系清潔級雄性小鼠36只（10～12周齡），采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（腹腔注射5 ml/kg生理鹽水）、對照組（腹腔注射5 ml/kg生理鹽水）、依那西普組（建立創(chuàng)傷后心肌缺血再灌注損傷模型，依那西普8 mg/kg）各12只，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各組小鼠再灌注30 min后的血漿TNF-α、3 h后的血清心肌肌鈣蛋白I（cTnI）濃度，測定各組再灌注24 h后的左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、采用TUNEL染色法檢測各組心肌細(xì)胞凋亡率、采用TTC雙染色檢測各組心肌梗死面積比值，采用免疫印跡法（Western-blot）檢測再灌注6 h后心肌跨膜蛋白受體Notch1胞內(nèi)活性片段（Notch1-ICD）、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白3（caspase-3）的表達(dá)。結(jié)果對照組、依那西普組大鼠的血漿TNF-α、血清cTnI水平、心肌Notch1-ICD、caspase-3蛋白表達(dá)水平、心肌細(xì)胞凋亡率、心肌梗死面積比值均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）；依那西普組血漿TNF-α、血清cTnI水平、心肌caspase-3蛋白表達(dá)水平、心肌細(xì)胞凋亡率、心肌梗死面積比值顯著低于對照組（P＜0.05），Notch1-ICD蛋白表達(dá)水平、LVEF值顯著的高于對照組（P＜0.05）。結(jié)論TNF-α抑制劑對創(chuàng)傷后心肌缺血再灌注損傷心肌具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與激活Notch1信號通路以調(diào)節(jié)caspase-3蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

腫瘤壞死因子-α抑制劑；跨膜蛋白受體Notch1信號通路；創(chuàng)傷；再灌注

創(chuàng)傷是造成人類死亡的重要原因之一，其能明顯增加患者心肌梗死和繼發(fā)性心功能不全的發(fā)生率，甚至造成死亡[1]。目前臨床上多采用心肌缺血再灌注的方式治療心臟性疾病，但容易導(dǎo)致心肌損傷，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。有研究表明[3]，Notch信號通路參與了多種氧化應(yīng)激和炎癥病理過程，與心肌梗死等心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切的關(guān)系。腫瘤壞死因子（TNF-α）抑制劑能夠有效拮抗TNF-α，并能增加炎性腸黏膜上皮細(xì)胞中Notchl的表達(dá)，從而提高了上皮黏膜局部血流灌注，進(jìn)一步減輕創(chuàng)傷后再灌注的損傷[4]。為了進(jìn)一步探討TNF-α抑制劑通過跨膜蛋白受體Notch1 信號通路對創(chuàng)傷性心肌損傷的保護(hù)作用，本研究將雄性小鼠成功建立創(chuàng)傷后心肌缺血再灌注損傷模型后隨機(jī)分為假手術(shù)組、對照組、依那西普組，探討了TNF-α抑制劑的保護(hù)性作用，報道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組選取c57系清潔級的雄性小鼠36只，10～12周齡，喂養(yǎng)于光照12 h，溫度23～25℃，相對濕度45%～60%，購買自上海加科生物科技有限公司。采用NobleCollip鼓建立創(chuàng)傷模型[3]，速率為40轉(zhuǎn)/min，創(chuàng)傷5 min（共200轉(zhuǎn)），并采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、對照組、依那西普組，每組小鼠12只。創(chuàng)傷模型建立7 d后再建立缺血再灌注損傷模型，具體方法如下：將小鼠麻醉后經(jīng)左胸前第4、5肋間暴露心臟，將冠狀動脈左前降支結(jié)扎30 min，松開扎線后實(shí)現(xiàn)再灌注。所有小鼠在造型成功后放回籠內(nèi)，呼吸空氣3～5 min后觀察小鼠能否恢復(fù)正常神智并活動自如。假手術(shù)組小鼠只暴露心臟后細(xì)線穿過冠狀動脈但不結(jié)扎，而對照組、依那西普組小鼠結(jié)扎前40 min分別腹腔注射5 ml/kg生理鹽水、依那西普8 mg/kg，灌注后6～8 h（經(jīng)過開胸、結(jié)扎、注射等過程）形成穩(wěn)定的模型。模型成功制備標(biāo)準(zhǔn)：II導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高，心臟表面區(qū)域變暗，再灌注后心電圖ST段下降1/3以上。

1.2 觀察指標(biāo)觀察灌注后TNF-α、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）水平的表達(dá)、Notch1-ICD、caspase-3蛋白的表達(dá)及左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、心肌細(xì)胞凋亡率、心肌梗死面積比值對照組。采用免疫印跡法（Western-blot）檢測再灌注6 h后心肌Notch1-ICD、caspase-3蛋白的表達(dá)，具體方法如下：稱取已進(jìn)行蛋白定量的各組織樣品，電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉液，4℃條件下封閉1 h。隨后加入Caspase-3蛋白抗體和抗Notchl胞內(nèi)片段抗體孵育過夜后檢測并分析結(jié)果。Caspase-3蛋白抗體和抗Notchl胞內(nèi)片段抗體均購自英國Abcam公司。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測小鼠灌注30min后的血漿TNF-α水平和灌注3 h后的血清心肌肌鈣蛋白I（cTnI）水平，酶標(biāo)儀為德國拜發(fā)儀器公司生產(chǎn)，檢測試劑盒均購自北京陸橋科技公司，具體檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。灌注24 h后利用2%異氟烷將小鼠進(jìn)行麻醉，然后利用小動物超聲系統(tǒng)測定小鼠的LVEF。將缺血心肌再灌注3 h后的心臟以4%的福爾馬林溶液內(nèi)固定24 h，作4～5 μm的石蠟切片，隨后采用TUNEL染色法測定心肌細(xì)胞凋亡水平（凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)出核深質(zhì)錢的暗綠色，心肌細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%）。TUNEL染色試劑盒購自瑞典Roche 公司，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用雙染色檢測各組心肌梗死面積比值，具體方法如下：將小鼠再次阻斷冠狀動脈并從冠狀動脈處打入1.5%伊文氏藍(lán)，染色30 s后將心臟取出并做冷凍切片。將切好的心臟薄片用PBS清洗干凈后在2%TTC溶液中37℃避光靜置30 min，隨后放在載玻片上置入裝有PBS的培養(yǎng)皿，拍照后利用軟件分析圖像，心肌梗死面積比值=梗死心肌面積/缺血再灌注心肌總面積×100%（心肌細(xì)胞梗死面積的計算采用南京凱基生物科技公司生存HSO系列超聲診斷儀器進(jìn)行診斷）。LVEF的表達(dá)測量采用南京凱基生物科技公司生存HSO系列超聲診斷儀器進(jìn)行診斷，頻率設(shè)置為3.5～5.5 MHz，由兩名富有經(jīng)驗(yàn)的超聲診斷醫(yī)師進(jìn)行診斷。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SAS 9.1統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量指標(biāo)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）進(jìn)行描述，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血漿TNF-α、血清cTnI水平比較對照組、依那西普組大鼠的血漿TNF-α、血清cTnI水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）；依那西普組血漿TNF-α、血清cTnI水平顯著低于對照組（P＜0.05）（表1）。

2.2 各組大鼠心肌Notch1-ICD、caspase-3蛋白表達(dá)比較對照組、依那西普組大鼠的心肌Notch1-ICD、caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著的高于假手術(shù)組（P＜0.05）；依那西普組心肌caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組（P＜0.05），Notch1-ICD蛋白表達(dá)水平顯著的高于對照組（P＜0.05）（表2）。

2.3 各組大鼠LVEF、心肌細(xì)胞凋亡率、心肌梗死面積比值比較對照組、依那西普組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率、心肌梗死面積比值顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），LVEF值顯著低于假手術(shù)組（P＜0.05）；依那西普組心肌細(xì)胞凋亡率、心肌梗死面積比值水平顯著低于對照組（P＜0.05），LVEF值顯著高于對照組（P＜0.05）（表3、圖1）。

表1 各組大鼠血漿TNF-α血清cTnI水平比較（s）

表1 各組大鼠血漿TNF-α血清cTnI水平比較（s）

注：TNF-α：腫瘤壞死因子-α；cTnI：心肌肌鈣蛋白I；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05，與對照組比較，bP＜0.05

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表2 各組大鼠心肌Notch1-ICD、caspase-3蛋白表達(dá)比較（s）

表2 各組大鼠心肌Notch1-ICD、caspase-3蛋白表達(dá)比較（s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與對照組比較，bP＜0.05；Notch1-ICD：心肌跨膜蛋白受體Notch1胞內(nèi)活性片段；caspase-3：細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白3

組別 例數(shù) Notch1-ICD/β-actin caspase-3/β-actin假手術(shù)組 12 0.27±0.09 1.05±0.08對照組 12 0.98±0.14a2.49±0.27a依那西普組 12 1.58±0.20ab1.42±0.22abF值 — 55.295 13.047 P值 — ＜0.001 0.007

3 討論

TNF-a是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一[5-7]；其主要由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，并有效能抑制成骨細(xì)胞和刺激破骨細(xì)胞[8]，對抑制心肌收縮、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及降低血壓等作用明顯[9,10]。TNF-α抑制劑可競爭性結(jié)合TNF-α受體，從而降低心肌梗死后白細(xì)胞浸潤和細(xì)胞外基質(zhì)破壞[11]。依那西普作為一種新型的TNF-α抑制劑可明顯阻斷TNF-α與膜表面受體結(jié)合，進(jìn)一步降低TNF-α的活性，從而抑制由TNF-α介導(dǎo)的多類異常免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[12]。依那西普能最大程度的保護(hù)創(chuàng)傷性心肌損傷小鼠的心臟功能，進(jìn)一步減少其心肌梗死面積，并抑制心肌細(xì)胞的凋亡[13]。依那西普等TNF-α抑制劑保護(hù)創(chuàng)傷性心肌損傷小鼠心臟功能與心肌Notchl信號通路的變化有密切關(guān)系[14]。Notchl是Notch蛋白的受體，其能釋放Notchl胞內(nèi)段轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)，進(jìn)而影響心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展。激活Notchl可促進(jìn)下游信號分子的表達(dá)進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)移起始因子的表達(dá)作用，并能減輕心肌損傷引起的氧化應(yīng)激與硝化應(yīng)激損傷，進(jìn)而保護(hù)缺血心肌細(xì)胞[13]。而TNF-α抑制劑能明顯激活黏膜上皮細(xì)胞中Notchl胞內(nèi)活性片段的表達(dá)，進(jìn)而減輕創(chuàng)傷性心肌損傷[13]。

圖1 各組大鼠心肌凋亡細(xì)胞TUNEL染色（100 μm）：綠色為凋亡細(xì)胞，藍(lán)色為所有細(xì)胞。

為了進(jìn)一步探討TNF-α抑制劑通過跨膜蛋白受體Notch1信號通路對創(chuàng)傷性心肌損傷的保護(hù)作用，本研究將雄性小鼠成功建立創(chuàng)傷后心肌缺血再灌注損傷模型后隨機(jī)分為假手術(shù)組、對照組、依那西普組，并對各組小鼠的血漿TNF-α、cTnI、LVEF、心肌細(xì)胞凋亡率和心肌梗死面積比值進(jìn)行了分析比較。研究結(jié)果表明，對照組大鼠的血漿TNF-α和cTnI水平顯著高于假手術(shù)組，而依那西普組則顯著低于對照組；說明TNF-α在創(chuàng)傷性心肌損傷的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用，而依那西普等TNF-α抑制劑能明顯降低TNF-α的水平，進(jìn)而降低心肌損傷的程度。依那西普組心肌細(xì)胞凋亡率、心肌梗死面積比值水平顯著低于對照組，心室射血分?jǐn)?shù)值顯著高于對照組（P＜0.05），說明TNF-α抑制劑能競爭TNF-α受體從而降低心肌細(xì)胞的凋亡率，并進(jìn)一步抑制再灌注后心肌梗死面積的擴(kuò)大。TNF-α抑制劑可以通過拮抗單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等對于心肌細(xì)胞膜的損傷，進(jìn)而減輕心功能的惡化，緩解病情的惡性進(jìn)展。但需要注意的是，Bomb R等[13]研究者的研究中并未發(fā)現(xiàn)TNF-α抑制劑治療后的心肌細(xì)胞凋亡率的改善，這與本研究的結(jié)論存在一定的差別，考慮到檢測方式的不統(tǒng)一、心肌細(xì)胞凋亡率的計算方法的不一致等，均可能導(dǎo)致了最終結(jié)論的差別。而進(jìn)一步觀察各組大鼠心肌Notch1-ICD、caspase-3蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，依那西普組caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著的低于對照組，Notch1-ICD蛋白表達(dá)水平顯著的顯著的高于對照組，提示TNF-α抑制劑能通過調(diào)節(jié)Notchl信號通路，進(jìn)而激活Notchl受體釋放大量Notch1-ICD，進(jìn)一步調(diào)控Hes1基因的表達(dá)，從而降低心肌損傷，更有效地保護(hù)了心肌細(xì)胞。

表3 各組大鼠LVEF%、心肌細(xì)胞凋亡率、心肌梗死面積比值比較（s）

表3 各組大鼠LVEF%、心肌細(xì)胞凋亡率、心肌梗死面積比值比較（s）

注：LVEF：左室射血分?jǐn)?shù)；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05，與對照組比較，bP＜0.05；LVEF：左室射血分?jǐn)?shù)

組別 例數(shù) LVEF（%） 心肌細(xì)胞凋亡率（%） 心肌梗死面積比值（%）假手術(shù)組 12 53.61±4.29 1.62±0.39 0對照組 12 27.50±3.95a20.50±3.14a44.61±4.18a依那西普組 12 45.08±5.17ab5.51±1.63ab30.52±4.25abF值 — 18.993 68.024 177.498 P值 — ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

綜上所述，TNF-α抑制劑能有效減少創(chuàng)傷后心肌缺血再灌注造成的心肌，并對損傷心肌具有良好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與激活Notch1信號通路有關(guān)。但本研究限于研究樣本不足，對TNF-α抑制劑調(diào)控Notchl信號通路的機(jī)制及TNF-α與心肌缺血再灌注損傷遠(yuǎn)期病死率的關(guān)系仍需作進(jìn)一步的深入研究。

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本文編輯：阮燕萍本文編輯：田洪榛，田國祥

Study of TNF-α inhibitor on myocardial reperfusion injury by activating Notch1 signaling pathway

WANG Wei-fang*, LIU Xiao, JI Xiao-ling, YANG Bo.*Department of Cardiology, Chifeng Hospital, Inner Mongolia, Chifeng 024000, China.
Correspondence author：WANG Wei-fang, E-mail: Yangvitor@163.com

ObjectiveTo investigate the protective effect of tumor necrosis factor-α (TNF-α) inhibitor (etanercept) through the transmembrane receptor signaling pathway on traumatic myocardial injury in mice.Methods36 male mice(10-12 weeks of age) were randomly divided into sham operation group(intraperitoneal injection of 5 ml/kg normal saline), control group (post - traumatic myocardial ischemia - reperfusion injury were prepared, intraperitoneal injection of 5 ml/kg normal saline) and etanercept group (post - traumatic myocardial ischemia -reperfusion injury were prepared, intraperitoneal injection Etanercept 8 mg/kg). TNF-αlevel at 30 minutes after reperfusion and serum cardiac troponin I (cTnI) concentration at 3 hours after reperfusion were measured by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). The left ventricular ejection fraction (LVEF) was measured 24 hours after reperfusion. TUNEL staining was used to measure the apoptotic rate of cardiomyocytes. The area of myocardial infarction was determined by TTC double staining. The expression levels of intracellular domain of Notch1 (Notch1-ICD) and caspase-3 were measured by western blot.ResultsThe levels of serum TNF-α and serum cTnI, and caspase-3, apoptotic rate of cardiomyocytes and the area of myocardial infarction in the control group and etanercept group were significantly higher than those in the sham operation group (P＜0.05). The levels of serum TNF-α and serum cTnI, the expression level of caspase-3, apoptotic rate of cardiomyocytes and the area of myocardial infarction in the etanercept group were significantly lower than those in the control group (P＜0.05). The value of LVEF and the expression level of Notch1-ICD were significantly higher than those in the control group (P＜0.05).ConclusionTNF-αinhibitors have protective effects on myocardium after myocardial ischemia-reperfusion injury, and its mechanism is related to activation of Notch1 signaling pathway to regulate the expression of caspase-3 protein.

Tumor necrosis factor-α inhibitor; Notch1 signaling pathway; Trauma; Reperfusion

R542.2

A

1674-4055(2016)12-1504-04

1024000 赤峰,內(nèi)蒙古赤峰市醫(yī)院心血管內(nèi)科

王衛(wèi)芳,E-mail:Yangvitor@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.12.26