葉筱燕，丁艷，蒙秉新，張燕，蘇建英，王玉文，王遠(yuǎn)志

（1.海南省人民醫(yī)院皮膚科，海南海口570102；2.海南省婦女兒童醫(yī)院皮膚科，海南?？?70206）

盤狀紅斑狼瘡患者T淋巴細(xì)胞CD70基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平的研究

葉筱燕1，丁艷2，蒙秉新1，張燕1，蘇建英1，王玉文1，王遠(yuǎn)志1

（1.海南省人民醫(yī)院皮膚科，海南海口570102；2.海南省婦女兒童醫(yī)院皮膚科，海南?？?70206）

目的研究盤狀紅斑狼瘡(DLE)患者T淋巴細(xì)胞CD70 mRNA的表達(dá)及CD70基因啟動(dòng)子DNA甲基化的狀態(tài)，探討CD70在DLE發(fā)病機(jī)制中作用。方法將2014年1月至2015年6月的15例活動(dòng)期、15例非活動(dòng)期DLE患者和15例正常人對(duì)照組外周血中T淋巴細(xì)胞的分離以及DNA、RNA提取，然后以定量RT-PCR測(cè)定CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞中CD70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，亞硫酸氫鈉基因測(cè)序法檢測(cè)CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞CD70基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平。結(jié)果活動(dòng)期、非活動(dòng)期和健康對(duì)照組DLE患者CD4+T淋巴細(xì)胞中的CD70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別為(0.82±0.21)、(0.61±0.15)和(0.43±0.11)，呈逐步遞減趨勢(shì)，且兩兩比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，活動(dòng)期、非活動(dòng)期DLE患者和健康對(duì)照CD4+T淋巴細(xì)胞CD70基因啟動(dòng)子序列-600～-300 bp區(qū)域平均甲基化水平分別為(0.29±0.05)、(0.41±0.03)和(0.59±0.02)，呈逐步遞增趨勢(shì)，且兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01).結(jié)論DLE患者T淋巴細(xì)胞中CD4+細(xì)胞CD70基因啟動(dòng)子區(qū)域的低甲基化狀態(tài)可能引起CD70過度表達(dá)，這為DLE疾病患者的檢測(cè)提供又一指標(biāo)。

盤狀紅斑狼瘡；T淋巴細(xì)胞；CD70基因；甲基化

盤狀紅斑狼瘡(DLE)是紅斑狼瘡(LE)的一個(gè)亞型。DLE是一種累及皮膚與黏膜的慢性結(jié)締組織疾病，其臨床特征是界限清楚的紅色斑塊、毛囊栓塞、鱗屑、毛細(xì)血管擴(kuò)張以及皮膚萎縮等，常見于女性[1-2]。目前對(duì)盤狀紅斑狼瘡的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，故臨床上至今仍缺乏有效的療法。

研究表明，T細(xì)胞DNA低甲基化調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)在免疫性疾病中扮演著重要的角色[3]。CD70全稱為腫瘤壞死因子配體超家族7因子，是CD27的配體，主要于活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞以及B細(xì)胞上表達(dá)[4]，目前普遍認(rèn)為CD70基因亦是狼瘡相關(guān)甲基化敏感基因之一[5-6]，CD27-CD70系統(tǒng)紊亂可導(dǎo)致一系列免疫異常且CD27抗原是DLE疾病活動(dòng)的一個(gè)標(biāo)志，故CD70基因的表達(dá)與免疫性疾病進(jìn)展活動(dòng)密切相關(guān)[7]。但T細(xì)胞CD70基因的甲基化是否在DLE的發(fā)病中也起到一定的作用，目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)的研究尚少，本研究通過研究DLE患者T淋巴細(xì)胞CD70 mRNA的表達(dá)及CD70基因啟動(dòng)子DNA甲基化的狀態(tài)，探討CD70的甲基化在DLE中的作用，以期為進(jìn)一步明確DLE在基因及分子水平的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料30例DLE患者，均符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ARA)1997年修訂的DLE診斷標(biāo)準(zhǔn)的四項(xiàng)指標(biāo)。其中活動(dòng)期DLE 15例，皆為本科室2014年1月至2015年6月住院及門診患者，女性13例，男性2例，平均年齡(26.8±5.7)歲；非活動(dòng)期DLE 15例，男性1例，女性14例，平均年齡(25.5±6.2)歲，皆為本科門診隨訪患者。健康對(duì)照組15例，皆為本院體檢中心健康體檢者，家族中無自身免疫性疾病史，女性14例，男性1例，平均年齡(26.5±5.3)歲。各組樣本來源的患者在性別和年齡構(gòu)成上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 試劑及其儀器CD70：5'-TGCTTTGGTCCCATTGGTCG-3'，5'-TCCTGCTGAGGTCCTGTGTGATTC-3'(上海博亞生物技術(shù)有限公司)。QPCR反應(yīng)儀為ABΙ 7500(ABΙ公司)；Real Time反應(yīng)試劑盒(OMEGA公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Sigma公司)；免疫磁珠(德國(guó)MiltenyiBiotec公司)；TRΙZOL試劑(美國(guó)Ιnvitrogen公司)；NaHSO3(美國(guó)Sigma公司)；Wizard@DNA純化樹脂(美國(guó)Promega公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 T淋巴細(xì)胞分離及其DNA、RNA抽提各組樣本中取靜脈血30 mL(肝素抗凝)。采用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離方法分離外周血單核細(xì)胞。按說明書操作用免疫磁珠分離T淋巴細(xì)胞CD4+和CD8+細(xì)胞。用TRΙZOL試劑按操作說明操作提取總RNA以及基因組DNA，檢測(cè)濃度及純度后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CD70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平任取樣本中所提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板。對(duì)倍稀釋成l/2×、1/4×、1/8×、1/16×、1/32×五個(gè)梯度，以此為模板分別以CD70基因與β-肌動(dòng)蛋白基因(內(nèi)參照基因)的特異引物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，2個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件如下：50℃15 min，1個(gè)循環(huán)；95℃15 min，1個(gè)循環(huán);94℃15 s，55℃30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃30 s；內(nèi)參基因?yàn)棣?肌動(dòng)蛋白：5'-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3'，5'-CTCAAGTTGGGGGACAAAAA-3'。

1.3.3 亞硫酸氫鈉基因測(cè)序法檢測(cè)CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞CD70基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平NaHSO3處理基因組DNA后，按Wizard@DNA純化樹脂說明書操作回收純化DNA。以特定引物序列PCR擴(kuò)增CD70基因調(diào)控序列片段后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化并測(cè)序：擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體進(jìn)行連接，由CaCl2將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)菌后培養(yǎng)，挑克隆、搖菌，再將經(jīng)鑒定為陽性的克隆后送測(cè)序。每個(gè)目的片段各送6個(gè)克隆測(cè)序，取平均值。測(cè)序由華大基因完成。計(jì)算患者的每個(gè)CpG位點(diǎn)的平均甲基化水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T淋巴細(xì)胞中CD70基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平情況活動(dòng)期、非活動(dòng)期DLE患者T淋巴細(xì)胞中CD70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且活動(dòng)期DLE患者的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于非活動(dòng)期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見圖1?；顒?dòng)期、非活動(dòng)期DLE患者T淋巴細(xì)胞中CD4+CD70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.01)?；顒?dòng)期DLE患者T淋巴細(xì)胞CD4+的CD70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平高于非活動(dòng)期DLE患者中的轉(zhuǎn)錄水平(P＜0.05)；活動(dòng)期、非活動(dòng)期DLE患者T淋巴細(xì)胞CD8+的CD70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平與健康對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖2。

圖1 DLE患者與正常對(duì)照組T淋巴細(xì)胞中CD70 mRNA的水平比較

圖2 CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞中CD70 mRNA的水平比較

2.2 PCR擴(kuò)增CD70基因調(diào)控區(qū)域片段以基因組DNA為模板擴(kuò)增CD70基因調(diào)控區(qū)域片段，條帶大小約1.3 kb，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后可以獲得大小一致的片段(圖3)。說明擴(kuò)增片段成功連入到T載體上。

圖3 PCR擴(kuò)增CD70基因

2.3 CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞的CD70基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)活動(dòng)期、非活動(dòng)期DLE患者組的CD4+細(xì)胞的基因啟動(dòng)子序列-1 000～-600 bp，～300 bp至轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間CG對(duì)的平均甲基化水平與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而在-600～-300 bp，包含有增強(qiáng)子3'端周邊區(qū)域，活動(dòng)期、非活動(dòng)期DLE患者組CG對(duì)的平均甲基化水平均明顯低于健康對(duì)照組(P均＜0.01)，且活動(dòng)期平均甲基化水平明顯低于非活動(dòng)期DLE患者組(P＜0.01)?；顒?dòng)期、非活動(dòng)期DLE患者組中CD8+細(xì)胞CD70基因啟動(dòng)子序列-1 000～-600 bp，-600～-300 bp，-300 bp至轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)CG對(duì)的平均甲基化水平與健康人比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 三組受檢后T淋巴細(xì)胞中CD70 mRNA的水平比較(±s)

表1 三組受檢后T淋巴細(xì)胞中CD70 mRNA的水平比較(±s)

注，與健康對(duì)照組比較，aP＜0.01；與非活動(dòng)組比較，bP＜0.01。

組別例數(shù)CD4+CD8+健康對(duì)照組非活動(dòng)組活動(dòng)組F值P值15 15 15 -1 000～-600 bp 0.80±0.02 0.83±0.07 0.81±0.04 5.8＞0.05 -600～-300 bp 0.59±0.02 0.41±0.03a0.29±0.05ab0.55＜0.01 -300～0 bp 0.23±0.01 0.19±0.06 0.20±0.04 0.75＞0.05 -1 000～-600 bp 0.91±0.04 0.89±0.03 0.92±0.02 0.40＞0.05 -600～-300 bp 0.82±0.06 0.84±0.03 0.85±0.04 0.94＞0.05 -300～0 bp 0.17±0.07 0.19±0.05 0.16±0.04 0.64＞0.05

3 討論

在機(jī)體處于變態(tài)反應(yīng)或者在自身免疫反應(yīng)等條件下，T淋巴細(xì)胞經(jīng)活化刺激后，可大量表達(dá)CD70[8-9]，T淋巴細(xì)胞與其配體CD27的結(jié)合，可以作為T淋巴細(xì)胞的輔助/共刺激信號(hào)進(jìn)而調(diào)控B細(xì)胞的激活[10]；而CD27-CD70的系統(tǒng)紊亂可導(dǎo)致一系列機(jī)體的免疫異常，CD27可以促進(jìn)人B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，與漿細(xì)胞的分化增強(qiáng)有關(guān)[11]；CD70與CD27的結(jié)合為B細(xì)胞分泌ΙgG抗體提供了協(xié)同刺激信號(hào)[12]，使得狼瘡患者外周血中B淋巴細(xì)胞的異常表達(dá)以及依賴T細(xì)胞分泌ΙgG[13-14]。因此CD70可能與疾病活動(dòng)密切相關(guān)，如在B細(xì)胞異?；钴S中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期、非活動(dòng)期DLE患者較健康對(duì)照組CD4+細(xì)胞CD70基因調(diào)控區(qū)域處于相對(duì)低的甲基化狀態(tài)，且活動(dòng)期較非活動(dòng)期DLE患者甲基化狀態(tài)更低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：活動(dòng)期、非活動(dòng)期DLE患者組CD4+細(xì)胞CD70基因調(diào)控區(qū)域中-600～-300 bp CG對(duì)的平均甲基化水平明顯低于健康對(duì)照組；活動(dòng)期、非活動(dòng)期DLE患者中CD4+細(xì)胞的CD70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于健康對(duì)照組。CD70基因中的部分啟動(dòng)子活躍性片段處于低甲基化狀態(tài)可能是CD70基因的被活化進(jìn)而引起其過度表達(dá)的原因，CD70基因的過度表達(dá)可能在DLE的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用。另外活動(dòng)期DLE患者較非活動(dòng)期患者的CD4+細(xì)胞CD70基因片段甲基化狀態(tài)更為低下且活動(dòng)期DLE患者CD4+細(xì)胞的顯著高于非活動(dòng)期DLE患者，提示CD70基因啟動(dòng)子甲基化水平可能通過影響其轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而與DLE的活動(dòng)性相關(guān)。而CD8+細(xì)胞的CD70基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)在DLE患者各組中以及與健康對(duì)照組之間的比較中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，DLE患者T淋巴細(xì)胞中CD4+細(xì)胞CD70基因啟動(dòng)子區(qū)域的低甲基化狀態(tài)可能引起CD70過度表達(dá)，這為DLE疾病患者新的檢測(cè)指標(biāo)上提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Study on methylation status of CD70 gene promoter in T cells from patients with discoid lupus erythematosus.

YE Xiao-yan1,DING Yan2,MENG Bing-xin1,ZHANG Yan1,SU Jian-ying1,WANG Yu-wen1,WANG Yuan-zhi1. 1.Department of Dermatology,Hainan General Hospital,Haikou 570102,Hainan,CHINA;2.Department of Dermatology, Maternal&Child Health Hospital of Hainan Province,Haikou 570206,Hainan,CHINA

ObjectiveTo detect the expressions of CD70 mRNA,determine the methylation status of CD70 gene promoter in T cells from patients with discoid lupus erythematosus(DLE),and explore the role of CD70 in mechanism of DLE.MethodsBlood samples were obtained from 15 patients with active DLE,15 patients with unreactive DLE and 15 normal human controls from January 2014 to June 2015.Quantitative RT-PCR was carried out to quantify the mRNA expression of CD70,and bisulfite sequencing was used to evaluate the methylation status of CD70 gene promoter in CD4+and CD8+T cells.ResultsThe transcriptional level of CD70 mRNA in CD4+T lymphocytes in active DLE patients,inactive patients and healthy controls were respectively(0.82±0.21),(0.61±0.15)and(0.43±0.11),with a decreasing trend.There are significant differences in each paired comparison(P＜0.01).The average methylation index of the region between-600 bp and-300 bp of CD70 gene promoter in CD4+T cells of the patients with active DLE(0.29±0.05)and inactive DLE (0.41±0.03),which was significantly lower than that in the healthy controls(0.59±0.02)(P＜0.01).ConclusionThe CD70 gene promoter in CD4+T cells is significantly hypomethylated in patients with DLE,which may directly lead to the overexpression of CD70,and could be used as an important index of disease detection in patients with DLE．

Discoid lupus erythematosus(DLE);T lymphocytes;CD70 gene;Methylation

R758.62

A

1003—6350（2016）13—2070—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.13.002

2016-01-14)

海南省衛(wèi)生廳衛(wèi)生計(jì)生行業(yè)科研項(xiàng)目（編號(hào)：瓊衛(wèi)2013自籌-33）

王遠(yuǎn)志。E-mail：wangyuanzhi407@163.com