張鋒，龐玉生，勞金泉

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科，廣西 南寧 530021)

肺動脈平滑肌細胞上TMEM16A的表達及其阻滯劑對細胞增殖的作用

張鋒，龐玉生，勞金泉

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科，廣西 南寧 530021)

目的 研究TMEM16A在大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)上的表達及其阻滯劑(T16Ainh-A01)對PASMCs增殖的作用。方法組織塊貼壁法分離正常大鼠PASMCs，原代培養(yǎng)。光鏡下觀察細胞形態(tài)，細胞免疫化學和細胞免疫熒光進行鑒定。細胞免疫熒光檢測TMEM16A在PASMCs上表達。原代培養(yǎng)的3～6代PASMCs分別在10 μmol/L T16Ainh-A01、20 μmol/L T16Ainh-A01和50 μmol/L T16Ainh-A01下培養(yǎng)24 h，用CCK-8法檢測細胞增殖情況。結(jié)果倒置顯微鏡下PASMCs以長梭形為主，細胞核卵圓形，部分細胞重疊區(qū)域呈典型的“峰-谷”狀結(jié)構。免疫學檢測顯示胞漿內(nèi)與細胞長軸平行的肌絲被染成棕黃色，標記肌絲的紅色熒光也與細胞長軸平行，標記細胞膜上的TMEM16A的綠色熒光可見表達，而細胞核不染色。CCK-8實驗檢測，相對于對照組，10 μmol/L T16Ainh-A01組細胞活力均數(shù)為(96.74±0.92)%，20 μmol/L T16Ainh-A01組均數(shù)為(92.21±1.25)%，50 μmol/L T16Ainh-A01組均數(shù)為(87.41±3.27)%，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。結(jié)論正常大鼠PASMCs表達TMEM16A；T16Ainh-A01可抑制PASMCs增殖，其抑制作用呈濃度依賴性；TMEM16A可能參與調(diào)控PASMCs增殖。

TMEM16A；肺動脈平滑肌細胞；阻滯劑；細胞增殖；原代培養(yǎng)

肺動脈高壓(Pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種與肺血管痙攣和肺血管重塑形成導致肺血管阻力持續(xù)增加密切相關的異常血流動力學疾病[1]。研究表明各種離子通道引起的膜電位變化調(diào)節(jié)著細胞增殖[2]。肺動脈中層的肺動脈平滑肌細胞(Pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)膜上的離子通道[如鈣激活性氯離子通道(CaCC)]參與調(diào)控PAH的發(fā)生。近年來發(fā)現(xiàn)CaCC的分子基礎是一種稱為跨膜蛋白16A(Transmembrane protein 16A，TMEM16A)[3-5]的物質(zhì)。有研究初步證實TMEM16A在PASMCs上的表達，并通過膜片鉗實驗記錄到了可靠的IClCa[6]。其特異性阻滯劑(TMEM16A inhibitor，T16Ainh-A01)主要用于PASMCs的電生理活動[7-8]及Cajal細胞及胰腺癌等癌細胞增殖的研究[9]，而對正常PASMCs增殖的作用尚未報道。因此本研究目的在于進一步探究TMEM16A在正常大鼠PASMCs上表達情況以及首次用T16Ainh-A01干預PASMCs，觀察對細胞增殖的作用，為尋找PAH治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 180～220 g清潔級SD大鼠，6～7周齡，雄性SD大鼠(廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK桂2009-0002)，胎牛血清(FBS，澳洲)、高糖DMEM培養(yǎng)基、含0.1%EDTA胰酶和青霉素-鏈霉素溶液(Wisent公司)，一抗α-actin(Santa公司)，二抗羊抗鼠lgG(H+L)PE標記(SBA公司)，一抗兔抗TMEM16A、二抗羊抗兔lgG FITC標記和T16Ainh-A01(Sigma公司)，PBS磷酸鹽、DMSO、DAPI溶液和4%多聚甲醛(Solarbio公司)，Triton X-100(Biosharp公司)，DAB試劑盒和羊血清(索萊寶公司)，CCK-8試劑盒(Vazyme公司)，普通倒置顯微鏡和熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)，CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)，酶標儀(Bio-tek公司)等。

1.2 方法

1.2.1 PASMCs的提取 參照文獻[10]并加以改進，置于4°C聚苯乙烯磺酸(PSS)液中在顯微鏡下小心分離肺動脈(第2～4分支肺動脈)。將已分離的肺動脈用眼科剪縱向剪開，內(nèi)膜面朝上，用眼科彎鑷背面來回刮幾次以去除內(nèi)膜，再將外膜面朝上，同樣方法刮去外膜。然后漂洗3次肺動脈中膜，直到液體清亮，以減少其他細胞混入。將中膜轉(zhuǎn)移至盛有0.5 mL的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)皿中，用眼科剪反復剪成約1 mm×1 mm的小組織塊。用滴管將小組織塊轉(zhuǎn)移至25T的細胞培養(yǎng)瓶中，均勻滴放至瓶底，間距約5 mm。加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，瓶底朝上，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育約2 h。待小組織塊干涸后，輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓培養(yǎng)基慢慢浸潤瓶底上的小組織塊。然后繼續(xù)靜置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 原代培養(yǎng) 前4～6 d不動培養(yǎng)瓶，以防止組織塊漂浮，1周左右換液。待細胞從組織塊周圍游離爬出來并直至生長融合成片，此時用胰酶消化傳代。傳代后一般2～3 d更換培養(yǎng)基，提取和培養(yǎng)PASMCs時都是用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。采用生長狀態(tài)較好的3～6代細胞進行后續(xù)試驗。

1.2.3 PASMCs的鑒定 (1)細胞形態(tài)學鑒定：在倒置相差顯微鏡下觀察提取PASMCs的形態(tài)；(2)細胞免疫化學鑒定：將第3代的PASMCs接種于24孔板內(nèi)的蓋玻片上，單層鋪滿后，收集細胞爬片。經(jīng)清洗、固定后，用SP法進行α-actin免疫化學染色，其工作滴度是1:400，DAB試劑盒顯色，蘇木精復染，脫水、透明、中性樹膠封片，鏡下觀察拍片；(3)細胞免疫熒光鑒定：用同樣方法收集細胞爬片。經(jīng)清洗、4%多聚甲醛固定、0.1%TritonX-100透化和10%山羊血清封閉后加入α-actin一抗4℃孵育過夜，工作濃度為1:100，再滴加lgG(H+L)-PE標記熒光二抗，工作濃度為1:400，DAPI(0.5 μg/mL)染核，最后蓋玻片倒置于滴有甘油的載玻片上，熒光下拍片。

1.2.4 TMEM16A在PASMCs上表達的檢測 免疫熒光法：參照文獻[11]并加以改進，前面步驟同PASMCs免疫熒光鑒定。加入一抗兔抗TMEM16A，4℃孵育過夜，工作濃度為1:1，再滴加羊抗兔lgG FITC標記二抗，工作濃度為1:5 000，DAPI(0.5 μg/mL)染核，最后蓋玻片倒置于滴有甘油的載玻片上，熒光下拍片。

1.2.5 實驗分組 選用第3～6代生長良好的PASMCs進行實驗。實驗處理前換用無血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞周期同步化，再隨機分成6組：對照組與10 μmol/L T16Ainh-A01組、對照組與20 μmol/L T16Ainh-A01組和對照組與50 μmol/L T16Ainh-A01組。

1.2.6 CCK-8法對PASMCs增殖的檢測 每孔約5×103個細胞，將100 μL PASMCs接種至96孔板(邊緣孔用PBS液填充)，設置空白孔(無細胞)、對照孔(有細胞，不加藥)和干預孔(有細胞，加不同濃度T16Ainh-A01)，每孔設3個復孔。置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱過夜，第二天倒置顯微鏡觀察基本貼壁。每孔換加入90 μL含10%FBS DMEM培養(yǎng)基和10 μL T16Ainh-A01 (最終濃度為10 μmol/L、20 μmol/L和50 μmol/L)，孵育24 h后每孔加入10 μL的CCK-8液，37°C孵育1 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm各孔的吸光度值(OD值)。結(jié)果分析：細胞活力%=(干預組OD-空白組OD)/ (對照組OD-空白組OD)×100%。實驗重復7次。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，兩組均數(shù)比較采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 原代PASMCs的形態(tài)學鑒定 貼壁的小組織塊4～6 d后逐漸有細胞從周圍爬出來，以爬出點為中心放射性貼壁生長，細胞以長梭形為主，也有星形或不規(guī)則形，細胞核呈卵圓形(圖1A)。8～12 d后細胞大部分鋪滿瓶底，重疊區(qū)域有典型的“峰-谷”生長特性(圖1B)。

圖1 原代PASMCs的形態(tài)學鑒定

2.2 原代PASMCs的細胞免疫化學和免疫熒光鑒定 α-actin的細胞免疫化學顯示，細胞質(zhì)有較多被染成棕黃色與細胞縱軸相平行的絲狀物，即為平滑肌細胞特有的肌動蛋白(圖2)。隨機選擇5個視野計300個細胞，見13個細胞沒有著色，判斷PASMCs的陽性率達95.66%。細胞免疫熒光顯示胞漿內(nèi)有與細胞縱軸平行的較強的紅色熒光，呈絲狀排列，而細胞核未染色，表明為目標細胞PASMCs(圖3)。

2.3 TMEM16A在原代PASMCs上表達檢測 免疫熒光顯示標記PASMCs膜上的TMEM16A可見綠色熒光，較暗，胞核不染色，證實正常PASMCs上有TMEM16A的表達(圖4)。

2.4 CCK-8細胞增殖抑制實驗結(jié)果 試驗發(fā)現(xiàn)隨著T16Ainh-A01的濃度不斷增高，所測OD值逐漸減小。相對對照組，10 μmol/L T16Ainh-A01組細胞活力均數(shù)為(96.74±0.92)%，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；相對于對照組，20 μmol/L T16Ainh-A01組細胞活力均數(shù)為(92.21±1.25)%，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；相對于對照組，50 μmol/L T16Ainh-A01組細胞活力均數(shù)為(87.41±3.27)%，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見圖5。

圖2 PASMCs的免疫細胞化學鑒定

圖3 PASMCs的細胞免疫熒光鑒定

圖4 TMEM16A在PASMCs上表達鑒定

圖5 不同濃度T16Ainh-A01干預后細胞活力的比較

3 討 論

目前國內(nèi)外原代PASMCs的獲取常用的方法有兩種，即酶消化法和組織塊貼壁法。酶消化法雖然有操作簡便、培養(yǎng)周期短、產(chǎn)量較高等優(yōu)點，但所需消化酶價格昂貴、消化時間難以把握，最主要的細胞相對不純影響后續(xù)實驗。本研究采取組織塊貼壁法獲得PASMCs[12]，用α-actin的細胞免疫化學鑒定發(fā)現(xiàn)，第三代的PASMCs純度達到95.66%。說明該方法原代培養(yǎng)PASMCs仍然不可避免的混雜有其他細胞，但經(jīng)過一兩次消化傳代后純度就已較高，基本滿足后續(xù)實驗的需求。TMEM16A是一種跨膜蛋白，其表達廣泛，多種細胞組織都有表達，參與多項病理生理活動。本研究應用細胞免疫熒光方法檢測發(fā)現(xiàn)正常大鼠PASMCs胞膜上存在TMEM16A的表達，該結(jié)論也進一步證實了Manoury等[6]和Forrset等[11]的發(fā)現(xiàn)，即TMEM16A在PASMCs上其RNA和蛋白都有表達，可能參與相應疾病的發(fā)生發(fā)展。T16Ainh-A01是直接作用于TMEM16A的特異性阻滯劑，其對TMEM16A的Cl-電流能明顯抑制并未干擾細胞信號通路上游的Ca2+信號，抑制IC50僅1 μmol/(Lol·L)左右，而相比于會產(chǎn)生抑制和刺激雙重作用的尼氟滅酸(Niflumic acid，NFA)，其只產(chǎn)生抑制效應[7-8，13]。本研究首次使用T16Ainh-A01干預PASMCs后發(fā)現(xiàn)其可抑制PASMCs的活力，從而抑制PASMCs增殖。進一步使用不同濃度的T16Ainh-A01時發(fā)現(xiàn)阻滯劑濃度與抑制作用呈明顯的正相關，即呈明顯的濃度依賴性。曾有研究發(fā)現(xiàn)運用膜片鉗技術使用10 μmol/L T16Ainh-A01即可完全抑制細胞膜上的IClCa[7]。隨著進一步深入研究，Mazzone等[9]采用膜片鉗技術運用 10 μ mol/L T16Ainh-A01干預原代培養(yǎng)的Cajal細胞電流IClCa受到抑制，與此同時運用T16Ainh-A01干預原代培養(yǎng)的Cajal細胞和胰腺癌癌細胞，發(fā)現(xiàn)其能夠抑制Cajalx細胞和胰腺癌癌細胞的增殖，這證實TMEM16A可能通過調(diào)控膜電流參與細胞增殖。同時也證實了慢性低氧性肺動脈高壓和野百合堿介導的肺動脈高壓的研究，TMEM16A的表達增高使得PASMCs上IClCa的密度和強度增加，可能致肺血管重塑和增強血管收縮張力，最終導致PAH的發(fā)生。而加入尼氟滅酸(NFA)，PASMCs上IClCa的密度和強度都會減弱，且血管張力舒張明顯[11]。然而，近來有一研究腦血管疾病的報道發(fā)現(xiàn)TMEM16A通過減少平滑肌細胞內(nèi)周期蛋白D1和周期蛋白E的表達來使細胞停留在G0/G1時期，從而抑制細胞增殖，這也說明了在不同的細胞組織其可能發(fā)揮著不同的功能[14]。

綜上所述，本研究證實了TMEM16A在PASMCs上的表達，T16Ainh-A01的作用也為TMEM16A在細胞周期中起的作用提供了強有力的證據(jù)。但該抑制劑只是針對離體正常的PASMCs，而在肺動脈高壓下其對PASMCs作用以及TMEM6A是以怎樣的信號通路調(diào)控細胞增殖及重塑的還需日后進一步研究。

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Expression of TMEM16A in pulmonary arterial smooth muscle cells and effect on cell proliferation by a selective TMEM16A inhibitor.

ZHANG Feng,PANG Yu-sheng,LAO Jin-quan.Department of Pediatrics,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo explore the expression of TMEM16A in rat pulmonary arterial hypertension (PASMCs)and effect of a TMEM16A inhibitor(T16Ainh-A01)on cell proliferation.MethodsTissue block anchorage was employed for the primary culture of rat PASMCs.Under light microscope,cell morphology was observed and identified by immunocytochemistry and immunofluorescence.The expression of TMEM16A in PASMCs was detected by immunofluorescence.The 3～6 passages of primary cultured PASMCs were respectively exposed to 10 μmol/L T16Ainh-A01,20 μmol/L T16Ainh-A01 and 50 μmol/L T16Ainh-A01 for 24 hours.Cell proliferation was detected by cell counting kit-8(CCK-8)assay.ResultsPASMCs tended to be long spindle,nuclear oval,and partial overlapping regions of the cells grew in a typical"peak-valley"mode under light microscope.Immunology results showed that the filaments in cytoplasm paralleled to cell long axis were stained brownish yellow and the red fluorescent marked filament paralleled to cell long axis were also showed.Meanwhile,TMEM16A marked with green fluorescence were visible,and the nuclear were non-staining.In CCK-8 assay,compared to control group,mean cell viability of 10 μmol/L,20 μmol/L, 50 μmol/L T16Ainh-A01 group was(96.74±0.92)%,(92.21±1.25)%,(87.41±3.27)%,respectively,and the differences were statistically significant(P＜0.01).ConclusionTMEM16A were exactly expressed in normal PASMCs.T16Ainh-A01 could inhibit the proliferation of PASMCs,and its inhibitory effect was concentration-dependent.TMEM16A may regulate PASMCs proliferation.

TMEM16A;Pulmonary arterial smooth muscle cells;Inhibitor;Cell proliferation;Primary culture

R-332

A

1003—6350（2016）11—1727—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.11.002

2016-03-02)

國家自然科學基金(編號：81160040)；廣西自然科學基金(編號：2013GXNSFAA019177)

龐玉生。E-mail:pangyush@163.com