田佳，張墨陽(yáng)，周忠義，謝曉紅

(海南省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?570010)

臍血干細(xì)胞移植與肝再生增強(qiáng)因子聯(lián)合治療急性肝衰竭的實(shí)驗(yàn)研究

田佳，張墨陽(yáng)，周忠義，謝曉紅

(海南省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?570010)

目的 觀察臍血干細(xì)胞移植與肝再生增強(qiáng)因子聯(lián)合治療急性肝衰竭大鼠的療效，以期為肝臟組織工程修復(fù)提供依據(jù)。方法建立肝衰竭大鼠模型40只，按照隨機(jī)數(shù)表法將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(采用腹腔注射生理鹽水)、臍血干細(xì)胞移植組(移植組，采用腹腔移植2×107臍血干細(xì)胞)、臍血干細(xì)胞移植聯(lián)合肝再生增強(qiáng)因子組(聯(lián)合組，采用腹腔移植2×107臍血干細(xì)胞聯(lián)合注射肝再生增強(qiáng)因子50 μg·kg-1·d-1)和肝再生增強(qiáng)因子組(增強(qiáng)因子組，采用腹腔注射肝再生增強(qiáng)因子50 μg·kg-1·d-1)，每組各10只。用DAPI標(biāo)記肝細(xì)胞。大鼠肝衰竭造模成功后，經(jīng)治療一個(gè)月后分別取四組大鼠的肝組織制作冰凍切片，并于熒光顯微鏡下觀察肝組織中DAPI標(biāo)記的細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果移植組肝臟歸巢及定植的干細(xì)胞為(12.6±2.0)個(gè)細(xì)胞/100倍視野，多于增強(qiáng)因子組的(8.1±3.4)個(gè)細(xì)胞/100倍視野，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，增強(qiáng)因子組到肝臟歸巢及定植的干細(xì)胞又多于對(duì)照組的(3.1±3.4)個(gè)細(xì)胞/100倍視野，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而聯(lián)合組肝臟歸巢及定植的干細(xì)胞為(18.1±3.4)個(gè)細(xì)胞/100倍視野，多于以上各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論不同干預(yù)手段對(duì)臍血干細(xì)胞歸巢、定植于肝臟有一定影響，聯(lián)合組的干細(xì)胞歸巢率優(yōu)于單行移植組和增強(qiáng)因子組。因此臍血干細(xì)胞移植聯(lián)合肝再生增強(qiáng)因子是一種較為理想的急性肝衰竭治療手段。

臍血干細(xì)胞；肝臟歸巢；急性肝衰竭；肝再生增強(qiáng)因子；定植

急性肝功能衰竭起病急、病死率高、疾病進(jìn)展快，嚴(yán)重威脅著人類的生命質(zhì)量。目前較為公認(rèn)的治療方法為同種異體肝移植，但是國(guó)內(nèi)可開(kāi)展該項(xiàng)治療的醫(yī)院較少，對(duì)技術(shù)要求較高，且供體肝臟來(lái)源及治療費(fèi)用的限制，因此制約了該項(xiàng)目的普及治療[1]。目前普遍采用的治療方法為內(nèi)科綜合治療，但是所取得的療效有限。盡管人類的肝臟具有較為強(qiáng)大的再生功能，且肝衰竭患者肝臟局部雖表達(dá)高水平的促肝細(xì)胞增殖因子，但是肝臟的再生能力仍不足，急性肝衰竭導(dǎo)致肝臟不能為機(jī)體提供足夠的肝功能支持，所致肝臟損傷及衰竭現(xiàn)象加重[2]。因此尋找一種高效、利用度高、供體來(lái)源相對(duì)容易、價(jià)格合理的方法，是該病治療亟待解決的問(wèn)題。若能夠補(bǔ)充一定數(shù)量的異體干細(xì)胞，同時(shí)還能抑制機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，既能起到阻止干細(xì)胞進(jìn)一步壞死的作用，同時(shí)還能夠保護(hù)現(xiàn)有的肝細(xì)胞，為減少肝功能的損傷提供支持，又為移植肝細(xì)胞免遭受異體的免疫排斥。為其提供足夠的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)間，達(dá)到修復(fù)肝臟，治愈肝衰竭的目的[3]。采用傳統(tǒng)的抗病毒及保肝治療已難以逆轉(zhuǎn)肝功能的好轉(zhuǎn)，而原位肝移植是目前治療最理想的手段。但由于供體、手術(shù)費(fèi)用昂貴和長(zhǎng)期使用免疫抑制劑等諸多因素阻礙了其推廣[4]。目前，干細(xì)胞移植研究在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，取得了令人矚目的成就。間充質(zhì)干細(xì)胞作為新型的生物治療手段，近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注，其具有在一定調(diào)解下可誘導(dǎo)向下一跨胚層分化的作用，通過(guò)旁分泌及自分泌等機(jī)制受到周圍組織環(huán)境等調(diào)控，促進(jìn)組織修復(fù)的作用[5]。臍血干細(xì)胞屬于中胚層的一類多能干細(xì)胞，其具有強(qiáng)大的分化潛能，可在特定條件下可以分化成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和肝細(xì)胞等多種細(xì)胞。而干細(xì)胞移植的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)也取決于其是否能有效的在肝臟中歸巢與定植。由于骨髓間充質(zhì)來(lái)源的干細(xì)胞取材有創(chuàng)性較大，且細(xì)胞數(shù)量在短時(shí)間內(nèi)難以達(dá)到需求，加上個(gè)體分化差異[6]。但是臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞具有臍血干細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)，且來(lái)源更為充足。肝再生增強(qiáng)因子是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的機(jī)體自身產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，其具有促進(jìn)肝細(xì)胞增殖及修復(fù)的作用，可通過(guò)直接刺激肝細(xì)胞，從而發(fā)揮促增殖的免疫調(diào)控作用[7-8]。由于臍血干細(xì)胞一直具有簡(jiǎn)單易行、對(duì)受體影響小、應(yīng)用靈活、價(jià)格相對(duì)低廉等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)發(fā)展較快，有望成為急性肝功能衰竭較為有效且有廣闊應(yīng)用前景的治療方法[9]。本研究建立肝衰竭大鼠模型，通過(guò)研究三種不同干預(yù)手段對(duì)肝衰竭大鼠進(jìn)行治療觀察，了解臍血干細(xì)胞其在肝臟的歸巢、定植及對(duì)肝再生的作用，對(duì)其產(chǎn)生的不同結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，為臍血干細(xì)胞移植聯(lián)合肝再生增強(qiáng)因子治療急性肝衰竭提供理論依據(jù)，并闡明移植中促干細(xì)胞歸巢的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)于2014年6月至2015年12月在海南醫(yī)學(xué)院分子實(shí)驗(yàn)室完成。取4周齡孕40 d大鼠40只，雌性，體質(zhì)量為200～250 g；40只8周齡、體質(zhì)量(200±10)g的雄性清潔級(jí)SD大鼠，均由海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供動(dòng)物合格證號(hào)：許可證號(hào)：SCXK (粵)2015-0020。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》，對(duì)動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 主要試劑及儀器 主要試劑及儀器的名稱和來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 主要試劑及儀器

1.3 方法

1.3.1 臍血干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)[10]取40只雌性大鼠頸椎脫臼法處死，無(wú)菌條件下剖腹抽取臍血干細(xì)胞，以DMEM培養(yǎng)基懸浮組織，移入10 cm2的培養(yǎng)皿中，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化1.5 h，棄消化液，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，加入含血清培養(yǎng)基后置5% CO2，37℃，飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。在24 h首次換液后，1 000 r/min離心5 min，棄上清后采用完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)之后，濃度調(diào)整到5×109/L，接種在培養(yǎng)瓶中，每3 d換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%～95%融合，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，5×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于25 mL培養(yǎng)瓶，標(biāo)記為P1，后每3～4 d換液，待細(xì)胞達(dá)到融合生長(zhǎng)后繼續(xù)傳代，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱單重進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，運(yùn)用倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和形態(tài)變化。使用P3代細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 形態(tài)學(xué)觀察[11]將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代細(xì)胞以5×104/mL種植于10 cm2培養(yǎng)皿中，每天在倒置相差顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞狀態(tài)并拍照，待細(xì)胞70%～80%融合，PBS洗3次，4%多聚甲醛15 min固定，雙蒸水沖洗，顯微鏡下拍照。

1.3.3 細(xì)胞表面抗原免疫熒光鑒定[12]4%多聚甲醛固定細(xì)胞之后，3%過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶15 min，使用PBS洗三次，0.5%的曲拉通打孔15 min，PBS洗3次，5%BSA封閉30 min，甩干，不洗，滴加兔多克隆抗體CD44、CD34、CD105，4℃過(guò)夜后，PBS洗5次，滴加生物素標(biāo)記二抗羊抗兔，PBS洗5次，常溫30 min，滴加SABC-FITC，SABC-CY3室溫30 min之后，PBS洗5次，Hoechst33258染核5 min，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡拍照。

1.3.4 DAPI標(biāo)記臍血干細(xì)胞[13]取P3代臍血干細(xì)胞，待細(xì)胞60%～70%融合時(shí)，培養(yǎng)液中加入終濃度為1 μg/mL的DAPI溶液，孵育12 h后用PBS洗滌至少6次，去除未與細(xì)胞結(jié)合的DAPI，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞標(biāo)記情況。

1.3.5 急性肝衰竭大鼠模型制備[14]取40只雄性大鼠，經(jīng)大鼠大鼠腹腔內(nèi)注射注射1.2 g/kg的D-氨基半乳糖，建立急性肝衰竭模型。肝臟組織病理學(xué)證實(shí)模型成功。

1.3.6 分組處理 40只雄性大鼠，按照隨機(jī)數(shù)表法將大鼠隨機(jī)分為四組。對(duì)照組采用腹腔注射生理鹽水、移植組采用腹腔移植2×107臍血干細(xì)胞，第1天2 mL，之后每天0.5 mL，連續(xù)注射6 d、聯(lián)合組采用腹腔移植2×107臍血干細(xì)胞聯(lián)合注射肝再生增強(qiáng)因子50 μg·kg-1·d-1，共6 d、增強(qiáng)因子組采用腹腔注射肝再生增強(qiáng)因子50 μg·kg-1·d-1，共6 d，每組各10只。用DAPI標(biāo)記肝細(xì)胞。以上各組治療后均動(dòng)態(tài)觀測(cè)1個(gè)月。

1.4 主要觀察指標(biāo) 對(duì)臍血干細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定，造模情況、臍血干細(xì)胞歸巢定植情況。大鼠急性肝衰竭后，經(jīng)治療一個(gè)月后分別取四組大鼠肝組織制作冰凍切片，并于熒光顯微鏡下觀察肝組織中DAPI標(biāo)記的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有采集的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。其中對(duì)符合正態(tài)分布資料的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，遵循正態(tài)分布而且方差齊性，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠臍血干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 早期分離培養(yǎng)的細(xì)胞呈圓形，隨后逐漸伸展，呈梭形的臍血干細(xì)胞顯著增多，散在或呈簇狀分布，見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠臍血干細(xì)胞的分離培養(yǎng)(×100)

2.2 大鼠臍血干細(xì)胞表面標(biāo)志物測(cè)定 免疫熒光法結(jié)果顯示細(xì)胞均一性較好，CD105+、CD44+、CD34+的陽(yáng)性率分別為6.18%、62.59%、73.66%，傳代貼壁生長(zhǎng)的梭形細(xì)胞為臍血干細(xì)胞，見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠臍血干細(xì)胞表面標(biāo)志物測(cè)定(×100)

2.3 動(dòng)物情況 大鼠于急性肝衰竭造模成功后半天內(nèi)開(kāi)始活動(dòng)、進(jìn)食和飲水。①對(duì)照組：2只于第二天后死亡，余8只均存活。②增強(qiáng)因子組：2只大鼠因門(mén)靜脈注入干細(xì)胞后止血不徹底而死亡，成活8只。③移植組：1只大鼠于注入干細(xì)胞后即出現(xiàn)呼吸困難、四肢無(wú)力而死亡，成活9只。④聯(lián)合組：有1只大鼠因移植后出現(xiàn)凝血功能障礙而死亡，成活9只。對(duì)照組中3只、臍血干細(xì)胞門(mén)靜脈移植組、臍血干細(xì)胞門(mén)靜脈移植聯(lián)合注射集落刺激因子組和臍血干細(xì)胞門(mén)靜脈移植聯(lián)合中藥灌胃組各有3只出現(xiàn)顯著的腹部膨隆，解剖腹腔發(fā)現(xiàn)大量清亮腹水。

2.4 臍血干細(xì)胞歸巢情況 臍血干細(xì)胞移植術(shù)后一個(gè)月，在熒光顯微鏡觀察肝組織中帶有藍(lán)色熒光的DAPI標(biāo)記陽(yáng)性的臍血干細(xì)胞細(xì)胞：肝臟歸巢及定植的干細(xì)胞聯(lián)合組＞移植組＞增強(qiáng)因子組＞對(duì)照組，各組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 臍血干細(xì)胞歸巢情況(個(gè)細(xì)胞/100倍視野)

3 討 論

多種原因引起的急性肝功能衰竭其病情危急、發(fā)病迅速、致死率極高，當(dāng)疾病浸入終末期時(shí)，傳統(tǒng)的藥物治療效果有效，不能及時(shí)有效發(fā)揮租用，目前臨床上較為公認(rèn)有效的方法為人工肝及肝移植之勞，但是由于要求條件較高且供體來(lái)源缺乏限制了其應(yīng)用的開(kāi)展[15]。間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種新型的生物治療手段，近年來(lái)不斷被大家認(rèn)識(shí)。其能夠誘導(dǎo)跨胚層分化，通過(guò)自分泌、旁分泌等機(jī)制發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及修復(fù)靶向組織的作用，在肝衰竭之后，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠靶向趨化、定植、歸巢，誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞，促進(jìn)肝細(xì)胞的再生，并表達(dá)肝細(xì)胞的相關(guān)功能，從而發(fā)揮修復(fù)肝臟[16]。以往應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但是由于其取材困難、數(shù)量有限，因此限制了其應(yīng)用。臍帶血具有某些生物特性，含有較多的造血祖細(xì)胞及干細(xì)胞，其具有較強(qiáng)的體外集落形成能力，可刺激細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)周期，且具有較強(qiáng)的自分泌和增殖能力，其能力優(yōu)于骨髓及外周血干細(xì)胞，因此近年來(lái)受到了廣泛關(guān)注[17]。臍血中具有T淋巴細(xì)胞群，其抗原抗體表達(dá)弱，因此排異反應(yīng)較弱，且細(xì)胞毒性較低，加上免疫系統(tǒng)不成熟，因此排斥反應(yīng)較少，一般情況下不會(huì)出現(xiàn)抗宿主反應(yīng)。同時(shí)臍血干細(xì)胞還具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，具有多向分化的潛能，可在細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下向靶細(xì)胞分化，加上其還具有較強(qiáng)的體外增殖能力，因此是組織工程修復(fù)的良好種子細(xì)胞[18]。

本研究通過(guò)建立肝衰竭大鼠模型，以探討該病有效的細(xì)胞治療效果。D-氨基半乳糖是公認(rèn)的建立急性肝衰竭動(dòng)物模型的藥物，其主要通過(guò)干擾肝臟內(nèi)UTP代謝，導(dǎo)致肝細(xì)胞RNA及蛋白質(zhì)代謝障礙，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死，造模之后我們通過(guò)病理檢查發(fā)現(xiàn)，急性肝衰竭肝組織出現(xiàn)大量溶解現(xiàn)象，肝小葉結(jié)構(gòu)崩解、嗜酸性粒細(xì)胞增多，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[19]。本研究通過(guò)成功建立急性肝衰竭模型，在造模之后，通過(guò)研究三種不同干預(yù)手段對(duì)肝衰竭大鼠進(jìn)行治療觀察，了解臍血干細(xì)胞其在肝臟的歸巢、定植及對(duì)肝再生的作用，對(duì)其產(chǎn)生的不同結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，為臍血干細(xì)胞移植聯(lián)合肝再生增強(qiáng)因子治療急性肝衰竭提供理論依據(jù)，并闡明移植中促干細(xì)胞歸巢的作用。

我們通過(guò)腹腔移植的方法，其移植數(shù)量較大，且操作簡(jiǎn)單、并發(fā)癥小、腹腔內(nèi)無(wú)明顯的粘連，可提高大鼠的存活率，大量臨床研究表明該移植途徑具有較高的安全性及可行性。通過(guò)四組不同干預(yù)手段的治療，結(jié)果提示，聯(lián)合組的肝臟歸巢及定植的干細(xì)胞多于移植組，而移植組的肝臟歸巢及定植的干細(xì)胞又多于增強(qiáng)因子組，增強(qiáng)因子組的肝臟歸巢及定植的干細(xì)胞又多于對(duì)照組，各組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。不同干預(yù)手段對(duì)臍血干細(xì)胞歸巢、定植于肝臟有一定影響，聯(lián)合組的干細(xì)胞歸巢率優(yōu)于移植組和增強(qiáng)因子組。肝再生增強(qiáng)因子是一種有效骨干再生因子，有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)肝再生因子的治療，可降低肝衰竭大鼠的死亡率，促進(jìn)肝再生，降低轉(zhuǎn)氨酶水平。本研究聯(lián)合使用臍血干細(xì)胞及肝再生增強(qiáng)因子治療之后，有效促進(jìn)了肝衰竭大鼠恢復(fù)，促進(jìn)臍血干細(xì)胞的定植歸巢，進(jìn)而促進(jìn)肝臟的肝細(xì)胞增殖及修復(fù)[20]。

綜上所述，臍血干細(xì)胞移植聯(lián)合肝再生增強(qiáng)因子是一種較為理想的急性肝衰竭治療手段，可促進(jìn)肝臟再生，改善肝臟組織及功能，提高存活率，且通過(guò)肝再生增強(qiáng)因子的移植可有效促進(jìn)臍血干細(xì)胞向肝細(xì)胞增殖分化。D-氨基半乳糖有效模擬了人體的急性肝衰竭病情，所采用的同種異體移植的方式與臨床上實(shí)際情況相似，為進(jìn)一步臨床治療提供了應(yīng)用依據(jù)，我們將進(jìn)一步深入探討該治療的免疫調(diào)控機(jī)理，為將來(lái)的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Experimental study of umbilical cord blood stem cell transplantation and augmenter of liver regeneration in the treatment of acute liver failure.

TIAN Jia,ZHANG Mo-yang,ZHOU Zhong-yi,XIE Xiao-hong.Intensive Care Unit, People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570010,Hainan,CHINA

ObjectiveTo observe the effect of umbilical cord blood stem cell transplantation and augmenter of liver regeneration(ALR)in the treatment of acute liver failure,in order to provide the basis for liver tissue engineering.MethodsForty rat models with liver failure,according to the random number table,were randomly divided into control group(intraperitoneal injection of normal saline),transplantation group(intraperitoneal transplantation of 2×107umbilical cord blood stem cells),combination group(intraperitoneal transplantation of 2×107umbilical cord blood stem cells combined with intraperitoneal injection ofALR 50 μg·kg-1·d-1)andALR group(intraperitoneal injection ofALR 50 μg·kg-1·d-1),with 10 rats in each group.Liver cells were labeled with DAPI.One month after treatment,liver tissue of the rats in the four groups were taken for frozen sections,and cell count was observed in liver tissue under fluorescence microscope based on DAPI label.ResultsThe stem cells of homing and colonization in combination group were(18.1±3.4)cells/100 magnification,which were significantly more than that in transplantation group of(12.6±2.0)cells/100 magnification,ALR group of (8.1±3.4)cells/100 magnification and control group of(3.1±3.4)cells/100 magnification,with statistically significant difference between each two of the four groups(P＜0.05).ConclusionDifferent intervention means had different effect on the homing and colonization of umbilical cord blood stem cells,and the homing rate of stem cells in the combination group was better than transplantation group and ALR group.Therefore,umbilical cord blood stem cell transplantation combined withALR is an ideal treatment for the treatment of acute liver failure.

Umbilical cord blood stem cells;Liver homing;Acute liver failure;Augmenter of liver regeneration (ALR);Colonization

R657.3

A

1003—6350（2016）19—3105—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.19.003

2016-03-05)

田佳。E-mail：tianjia8898@sina.com