吉圣珺，葉志堅(jiān)，陳耀豐，劉劍，張培芳，鄭韶欣

(1.佛山市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 佛山 528000；2.廣州市中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510120)

·論 著·

TNF-α誘導(dǎo)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡Caspase-3活性的研究

吉圣珺1，葉志堅(jiān)1，陳耀豐1，劉劍1，張培芳1，鄭韶欣2

(1.佛山市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 佛山 528000；2.廣州市中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510120)

目的 探討凋亡“核心蛋白酶”-半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)在腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HPMVECs)凋亡中的作用。方法體外培養(yǎng)HPMVECs，空白對(duì)照組置于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，TNF-α組分別以10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL濃度刺激HPMVECs，使用MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞活性，AnnexinⅤ/PI雙染色聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Caspase-3的活性。結(jié)果空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率及Caspase-3活性最低；空白對(duì)照組和TNF-α組(10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL)比較，100 ng/mL TNF-α組的相對(duì)細(xì)胞活性最低，而細(xì)胞凋亡率及Caspase-3活性最高，TNF-α誘導(dǎo)HPMVEC凋亡時(shí)呈現(xiàn)出濃度依賴性，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Caspase-3活性逐漸升高(P＜0.05)。結(jié)論TNF-α誘導(dǎo)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)濃度依賴性，Caspase-3可能參與了這一細(xì)胞凋亡過(guò)程的調(diào)控。

腫瘤壞死因子-α；人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞；凋亡；半胱氨酸蛋白酶-3

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一。肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary hypertension，PH)是其常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，PH的發(fā)生與COPD患者死亡率的顯著增加相關(guān)[1]。缺氧及炎癥引起肺血管收縮及重構(gòu)是慢性阻塞性肺疾病發(fā)生肺動(dòng)脈高壓的重要病理生理基礎(chǔ)，肺血管內(nèi)皮損傷是PH發(fā)病的起始環(huán)節(jié)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是血管內(nèi)皮損傷的重要機(jī)制[2-3]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族是一組特異性切割天冬氨酸殘基上的肽鍵繼而引起細(xì)胞凋亡的蛋白水解酶，是所有凋亡蛋白中最主要的執(zhí)行者[4]。Caspase-3在血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)路徑中占據(jù)著的核心地位，是凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的共同通路[5]。目前尚未見(jiàn)到有關(guān)于TNF-α誘導(dǎo)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HPMVEC)凋亡與Caspase-3活性變化的相關(guān)報(bào)道。本研究探討了TNF-α誘導(dǎo)HPMVEC的凋亡及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 HPMVEC株購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，100 mL/L胎牛血清及高糖細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Hy-clone公司，四甲基偶氮唑藍(lán)購(gòu)自Sigma公司，Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒、流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶(AnnexinⅤ-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，AnnexinⅤ-FITC/PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司。

1.2 HPMVEC的復(fù)蘇和傳代培養(yǎng) 從液氮保存罐中取出凍存管(含原代HPMVEC)，立即放入37℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。將其置于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。內(nèi)皮細(xì)胞呈鵝卵石樣貼壁生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合時(shí)用2.5 g/L乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，取第4代血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 空白對(duì)照組：用100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基處理內(nèi)皮細(xì)胞，置于50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；TNF-α組：分別用10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL TNF-α進(jìn)行刺激，然后用100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基處理內(nèi)皮細(xì)胞，置于50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 MTT法檢測(cè)HPMVEC的增殖活性 MTT比色法測(cè)定各組細(xì)胞的活性。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)；以4 000個(gè)/孔細(xì)胞接種到96孔板中。37℃、50 mL/L CO2條件下孵育1 d；棄去培養(yǎng)液，按上述實(shí)驗(yàn)分組方法處理細(xì)胞。吸干培養(yǎng)基，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，置搖床上低度振蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)各孔的吸光度(A)值。細(xì)胞活力=(A處理組-A空白管)/(A空白對(duì)照組-A空白管)× 100%。

1.5 AnnexinⅤ/PI雙染色聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HPMVEC的凋亡 細(xì)胞分為空白對(duì)照組、TNF-α處理組。每組取3個(gè)6孔板的培養(yǎng)孔，胰蛋白酶消化(不含EDTA)收集細(xì)胞，1 000×g離心5 min，棄上清。磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞后，離心，重復(fù)兩次后棄上清。分別加入結(jié)合緩沖液200 μL重懸并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)。取200 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL annexinⅤ-FITC混勻，室溫避光10 min。再加入5 μL PI染液混勻，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析：每份樣品取1×104個(gè)細(xì)胞PI染色，做DNA分析。

1.6 Caspase-3的活性檢測(cè) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、TNF-α處理組。分別收集各組細(xì)胞。1 500 r/min離心10 min，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次；4℃、300×g離心5 min，收集(1～5)×105個(gè)細(xì)胞；加氟甲基酮標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄因子2-天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸(Transcription factor 2-Asp-Glu-Val-A sp-fluoromethylketone，TF2-DEVD-FMK)，37℃反應(yīng)1 h；流式細(xì)胞術(shù)分析Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度[6-7]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性 10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mLTNF-α處理組與100 ng/mLTNF-α處理組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而100 ng/mL TNF-α處理組的相對(duì)細(xì)胞活性明顯低于空白對(duì)照組(P＜0.01)，TNF-α對(duì)細(xì)胞活性的抑制與TNF-α劑量呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，見(jiàn)表1。

組別空白對(duì)照組TNF-α處理組10 ng/mL 20 ng/mL 50 ng/mL 100 ng/mL OD值1.97±0.05相對(duì)細(xì)胞活性(%) 100±0.00 1.84±0.01 1.81±0.02a1.71±0.02a1.53±0.02abcd93.68±3.30 92.24±2.55a87.30±2.64a77.93±2.97abcd

2.2 AnnexinⅤ/PI檢測(cè)HPMVEC凋亡 10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL TNF-α處理組與空白對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而100 ng/mL TNF-α處理組的細(xì)胞凋亡率最高(P＜0.01)，TNF-α對(duì)細(xì)胞活性的抑制與TNF-α劑量呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，見(jiàn)表2。

表2 不同劑量TNF-α刺激下HPMVEC的凋亡率檢測(cè)(n=3，±s)

表2 不同劑量TNF-α刺激下HPMVEC的凋亡率檢測(cè)(n=3，±s)

組別空白對(duì)照組TNF-α處理組10 ng/mL 20 ng/mL 50 ng/mL 100 ng/mL細(xì)胞凋亡率(%) 0.00±0.005 5.57±0.23a6.69±0.17ab8.67±0.25abc10.76±0.25abcd

2.3 HPMVEC的Caspase-3活性檢測(cè) 10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL TNF-α處理組與空白對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為43.85、96.24、26.45，P值分別為0.000 5、0.000 1、0.001，P＜0.05)，而100 ng/mL TNF-α處理組的Caspase-3活性最高(t=16.77，P= 0.004)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Caspase-3活性逐漸升高，與空白對(duì)照組比較，100 ng/mL TNF-α組在24 h時(shí)Caspase-3的活性最高(t=62.06，P=0.003)，見(jiàn)表3。

表3 不同劑量TNF-α刺激下HPMVEC的Caspase-3活性檢測(cè)(n=3，±s)

表3 不同劑量TNF-α刺激下HPMVEC的Caspase-3活性檢測(cè)(n=3，±s)

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與10 ng/mL TNF-α組比較，bP＜0.05；與20 ng/mL TNF-α組比較，cP＜0.05；與50 ng/mL TNF-α組比較，dP＜0.05；與0 h組比較，eP＜0.05；與6 h組比較，fP＜0.05；與12 h組比較，gP＜0.05。

組別Caspase-3活性(%) 0 h 6 h 12 h 24 h空白對(duì)照組TNF-α處理組10 ng/mL 20 ng/mL 50 ng/mL 100 ng/mL 0.39±0.184.98±0.585.79±0.386.03±0.38 15.36±0.92aefg17.37±0.92aefg24.56±0.77abcefg25.39±0.59abcdef5.2±0.33a5.98±0.16a8.12±0.47abc11.33±1.00abcd9.2±0.56ae10.52±0.82ae13.39±1.00abce16.65±0.72abcde10.97±0.97ae14.05±0.55abef16.85±0.85abcef23.60±0.80abcdef

3 討 論

COPD是常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率及病死率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)，目前已成為全球第四大致死性病因[8]。PH是其重要的合并癥，炎癥反應(yīng)是COPD患者形成PH的重要因素[9]，炎癥引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是PH發(fā)生的重要機(jī)制[10]。近年來(lái)，有關(guān)于血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與PH之間的研究逐漸增多[11-13]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10 ng/mL的TNF-α即可引起HPMVEC發(fā)生凋亡，隨著TNF-α濃度的增加，HPMVEC凋亡率亦增加；100 ng/mL的TNF-α作用于HPMVEC時(shí)，細(xì)胞凋亡率最高，TNF-α對(duì)細(xì)胞活性的抑制與TNF-α劑量呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。Chen等[14]研究也支持本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。Kim等[15]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡的增加與Caspase-3的表達(dá)增強(qiáng)相關(guān)。

筆者進(jìn)一步探討了TNF-α誘導(dǎo)HPMVEC凋亡的分子機(jī)制。目前研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡主要有兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，分別由Caspase-8激活的外源性途徑即死亡受體途徑及Caspase-9激活的細(xì)胞內(nèi)在途徑即線粒體通路，而兩者最終均需要通過(guò)激活Caspase-3來(lái)實(shí)現(xiàn)，因此，目前認(rèn)為，Caspase-3是血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著TNF-α作用濃度的增加及時(shí)間的延長(zhǎng)，Caspase-3的活性表達(dá)亦隨之增強(qiáng)，Caspase-3的活性表達(dá)與HPMVEC凋亡率的增加呈正相關(guān)關(guān)系。與Ohtsubo等[16]研究結(jié)果相符合。有關(guān)于血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的探討是近年來(lái)PH的研究熱點(diǎn)，除了 Caspase-3通路，還包括 PI3K/AKT[17]、P38MAPK[18]及STAT3[19-20]等通路途徑。在未來(lái)的研究中，我們將進(jìn)一步探討Caspase-3的上游信號(hào)通路，進(jìn)一步了解TNF-α誘導(dǎo)HPMVEC凋亡的完整信號(hào)分子傳導(dǎo)途徑。

綜上所述，筆者認(rèn)為TNF-α可誘導(dǎo)HPMVEC發(fā)生凋亡，并且這一凋亡作用呈現(xiàn)濃度依賴性。而在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Caspase-3的活性表達(dá)增強(qiáng)，因此，TNF-α誘導(dǎo)HPMVEC凋亡可能與上調(diào)Caspase-3的活性表達(dá)有關(guān)。

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Caspase-3 activity in TNF-α-induced apoptosis of human pulmonary microvascular endothelial cells.

JI Sheng-jun1,YE Zhi-jian1,CHEN Yao-feng1,LIU Jian1,ZHANG Pei-fang1,ZHENG Shao-xin2.1.Department of Respiratory Medicine,the First People's Hospital of Foshan,Foshan 528000,Guangdong,CHINA;2.Department of Cardiology,Sun Yat-sen Memorial Hospital of the Sun Yat-sen University,Guangzhou 510120,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the change of Caspase-3 activity in tumor necrosis factor-α(TNF-α)induced apoptosis of human pulmonary microvascular endothelial cells(HPMVECs).MethodsHPMVECs were cultured in vitro.The blank control was treated in a carbon dioxide incubator.HPMVECs were treated by TNF-α at the concentration of 10 ng/mL,20 ng/mL,50 ng/mL,or 100 ng/mL.The activity of cells,apoptosis rate,as well as the expressions of Caspase-3 in HPMVECs were determined respectively by MTT cell viability assay,flow cytometric analysis with dual Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)staining and flow cytometry.ResultsApoptosis rate of cell and Caspase-3 activity were the lowest in the blank control group.Compared with the other groups(10 ng/mL,20 ng/mL,50 ng/mL),the Caspase-3 activity and apoptosis rate of cell in 100 ng/mL TNF-α group were highest,and with the lowest cell activity. The inhibition of TNF-α-induced cell activity was a manner of dose-dependent.The Caspase-3 activity increased gradually with time(P＜0.05).ConclusionTNF-α-induced apoptosis of HPMVEC is a manner of dose-dependent,and Caspase-3 may be taking part in the control of apoptosis process.

Tumor necrosis factor-α(TNF-α);Human pulmonary microvascular endothelial cells(HPMVECs);Apoptosis;Caspase-3

R329.2+7

A

1003—6350（2016）14—2237—04

2016-02-23)

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81400251)；廣東省佛山市衛(wèi)生及計(jì)生局醫(yī)學(xué)科研立項(xiàng)課題(編號(hào)：2015255)

鄭韶欣。E-mail：schwannnn@163.com