李虹椿，　李　霞，　馬雪濤，　肖　婕，3，　牛之瑞，　馮　雷，　李　凡△

(1昆明醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)系，云南 昆明 650500；2云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，云南 昆明 650223;3黃石中心醫(yī)院理科，湖北 黃石435000)

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米諾環(huán)素對新生鼠缺氧后腦室周圍區(qū)域谷氨酸清除的影響*

李虹椿1，李霞1，馬雪濤2，肖婕1，3，牛之瑞2，馮雷2，李凡1△

(1昆明醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)系，云南 昆明 650500；2云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，云南 昆明 650223;3黃石中心醫(yī)院理科，湖北 黃石435000)

[摘要]目的： 探討米諾環(huán)素對新生大鼠缺氧后腦室周圍區(qū)域谷氨酸的作用及其可能的機制。方法: 對出生后1 d的大鼠給予系統(tǒng)性缺氧構(gòu)建缺血缺氧性腦損傷模型(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測缺氧后4 h和1 d腦室周圍區(qū)域谷氨酸水平；Western blot觀察該區(qū)域EAAT1和EAAT2發(fā)育期變化以及EAAT1、EAAT2、Iba-1、IL-1β、TNF-α和TGF-β1蛋白在缺氧后4 h和1 d的動態(tài)變化，并同時觀察給予米諾環(huán)素后對谷氨酸水平及上述蛋白的影響。結(jié)果: 谷氨酸水平檢測發(fā)現(xiàn)，缺氧后4 h和1 d，腦室周圍區(qū)域谷氨酸水平明顯上升；給予米諾環(huán)素(45 mg/kg)后，谷氨酸水平顯著下降。Western blot結(jié)果顯示，出生后第1周EAAT1和EAAT2低表達，但在出生后第2周表達顯著上升；缺氧后1 d，EAAT1、EAAT2、Iba-1、IL-1β和TGF-β1表達上調(diào)；給予米諾環(huán)素后能促進EAAT1和TNF-α的表達，但卻抑制EAAT2的產(chǎn)生。結(jié)論: 缺氧后早期，米諾環(huán)素能降低腦室周圍區(qū)域谷氨酸水平，其機制可能與它選擇性調(diào)控谷氨酸轉(zhuǎn)運體，而非抑制該區(qū)域炎癥反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]米諾環(huán)素； 腦室周圍區(qū)域； 缺氧； 谷氨酸； 谷氨酸轉(zhuǎn)運體

新生兒缺血缺氧性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是指圍產(chǎn)期由各種因素引起的缺氧和腦血流減少或暫停而引發(fā)胎兒和新生兒的腦損傷，該病是導(dǎo)致兒童神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的常見原因之一，而缺氧為其病理生理基礎(chǔ)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HIE存在腦室周圍區(qū)域易損現(xiàn)象[1]，該區(qū)域受損是導(dǎo)致患兒神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂和認(rèn)知功能障礙的主要原因。

谷氨酸(glutamate)是腦內(nèi)含量最多的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在突觸信號傳遞及認(rèn)知功能的維系中發(fā)揮重要作用。缺血缺氧(hypoxia-ischemia，HI)后，大腦白質(zhì)，尤其腦室周圍白質(zhì)區(qū)域的谷氨酸水平升高[2]。胞外過多的谷氨酸會持續(xù)激活谷氨酸受體并使胞內(nèi)Ca2+持續(xù)增高，引發(fā)一系列毒性反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性、壞死、誘發(fā)腦損傷。該過程也被稱為谷氨酸所介導(dǎo)的興奮性毒性作用?？梢奌I后，谷氨酸在腦室周圍區(qū)域易損中起著重要的作用，維持該區(qū)域谷氨酸水平的穩(wěn)定將有助于減輕HI后腦損傷。

研究認(rèn)為谷氨酸清除主要受谷氨酸轉(zhuǎn)運體調(diào)節(jié)。人類已發(fā)現(xiàn)5種位于細(xì)胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn)運體，分別是興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體1～5(excitatory amino acid transporter 1～5，EAAT1～5)；而在嚙齒類動物中也發(fā)現(xiàn)4種同系物。其中EAAT1和EAAT2是調(diào)節(jié)谷氨酸的主要轉(zhuǎn)運蛋白，并大量分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞上。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，EAAT1是清除谷氨酸的主要蛋白；而EAAT2則主要負(fù)責(zé)成人腦組織中谷氨酸的轉(zhuǎn)運。目前，對出生后早期腦室周圍區(qū)域谷氨酸轉(zhuǎn)運體的表達情況未見報道，缺氧后與谷氨酸水平變化的關(guān)系不清。

近年研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸的產(chǎn)生與HI后腦內(nèi)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。腦內(nèi)炎癥反應(yīng)主要以小膠質(zhì)細(xì)胞活化為特征。小膠質(zhì)細(xì)胞在受到各種刺激(包括HI)后由靜息狀態(tài)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)并啟動腦內(nèi)炎癥反應(yīng)?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞除產(chǎn)生和釋放過多炎癥介質(zhì)外，還能釋放谷氨酸。而炎癥介質(zhì)(IL-1β、TNF-α等)可通過損傷神經(jīng)元并導(dǎo)致其產(chǎn)生和釋放更多的谷氨酸[3]，誘發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上谷氨酸轉(zhuǎn)運體功能障礙[4]等方式，使胞外谷氨酸水平升高。同樣抗炎因子(TGF-β1等)在HI后也會高表達，它能促進神經(jīng)元存活，減輕腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，抑制谷氨酸產(chǎn)生。因此，缺氧后新生大鼠腦室周圍區(qū)域的炎癥反應(yīng)及其與谷氨酸間可能的關(guān)系還有待進一步研究。

米諾環(huán)素(minocycline,M)是一種四環(huán)素類廣譜抗生素。由于其脂溶性好，易透過血腦屏障，在多種腦損傷模型中發(fā)揮神經(jīng)保護作用，也包括HIE后腦損傷。其保護機制與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，繼而減輕腦內(nèi)炎癥反應(yīng)有關(guān)。既然米諾環(huán)素能抑制HI后腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，那么它是否也對谷氨酸的清除產(chǎn)生影響，這成為本研究的目的。

據(jù)此，本研究采用谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT1和EAAT2，炎癥介質(zhì)IL-1β和TNF-α，抗炎因子TGF-β1以及小膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物Iba-1為研究對象，觀察缺氧后腦室周圍區(qū)域谷氨酸水平的改變，并結(jié)合谷氨酸轉(zhuǎn)運體以及炎癥介質(zhì)表達的變化，揭示缺氧后該區(qū)域谷氨酸變化可能的機制以及米諾環(huán)素對其的影響。

材料和方法

1實驗動物

SD新生大鼠體重(6±1)g，SPF級，雌雄各半，由昆明醫(yī)科大學(xué)動物飼養(yǎng)和使用委員會提供。每窩新生鼠10～12只與母鼠同籠飼養(yǎng)，保證食物及水供應(yīng)，動物許可證編號為SYXK(滇)2011-0004。

2藥品和試劑

米諾環(huán)素(Sigma)；水合氯醛(索萊寶公司)； PVDF膜(Millipore)；脫脂奶粉(BD)；anti-EAAT1和anti-TGF-β1(Santa Cruz)；anti-EAAT2、anti-IL-1β、anti-TNF-α和anti-β-actin(Abcam)；anti-Iba-1(Wako)；anti-mouse IgG-HRP和anti-rabbit IgG-HRP(Abmart)。

3實驗方法

作為食品領(lǐng)域的高風(fēng)險行業(yè)，我國特殊食品管理要求最高、制度最多、措施最嚴(yán)。如今，在各界的共同努力下，我國特殊食品管理制度不斷完善，產(chǎn)業(yè)環(huán)境日趨向好，安全指數(shù)逐年攀升，消費者信心不斷增強。據(jù)統(tǒng)計，2017年國產(chǎn)嬰幼兒配方乳粉合格率達99.1%，保健食品監(jiān)督抽檢總體樣品合格率達98.1%，特殊食品安全達到歷史最好水平。

3.1動物系統(tǒng)性缺氧及藥物干預(yù)本實驗采用同窩出生后1 d的SD大鼠幼崽，置入恒溫缺氧實驗裝置，在28 ℃、5% O2+ 95% N2混合氣體中暴露3.5 h[5]。系統(tǒng)性缺氧結(jié)束后，大鼠隨機分為缺氧(hypoxic，Hy)組(缺氧后2 h腹腔注射生理鹽水8 μL)和米諾環(huán)素(Hy+M)組(缺氧后2 h腹腔注射米諾環(huán)素45 mg/kg[6])，并設(shè)置同齡正常組(normal group，NG)。NG組置于21% O2、28 ℃的環(huán)境中，不予處理。

3.2液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測谷氨酸缺氧后4 h和1 d，對各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g)后，分離腦室周圍區(qū)域，見圖1。用高效液相串聯(lián)質(zhì)譜分析儀檢測該區(qū)域單位重量腦組織中谷氨酸的濃度。樣品前處理：使用色譜級甲酸與樣本一起進行超聲乳化勻漿后，12 000 r/min離心20 min，吸取上清液，經(jīng)0.2 μm的濾膜進行過濾。然后按條件[色譜柱: 1.7 μm，100 mm×2.0 mm，柱溫30 ℃，流動相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，流速0.3 mL/min，進樣量5 μL]進行分析，流動相梯度洗脫程序見表1。質(zhì)譜條件為電噴霧電離(ESI)，正離子化模式，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，毛細(xì)管噴霧電壓(IS)5 500 V；氣簾氣(CUR)：15.0 psi；碰撞室碰撞氣(CAD)：5 psi；離子源溫度(TEM)：650 °C；霧化氣(GS1)：60 psi；輔助氣(GS2)：65 psi；所用氣體均為高純氮氣(純度99.999%)；去簇電壓(DP)：13 V；其它條件見表2。優(yōu)化后母離子為148.0，定性子離子為m/z 84.1和m/z 130.1，定量離子為m/z 84.1，檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。在完成谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜分析后，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對樣本進行分析，將計算得出的峰面積代入方程，算出樣本中谷氨酸濃度。

Figure 1.Periventricular zone.

圖1腦室周圍區(qū)域

表1　流動相洗脫程序

表2　串聯(lián)質(zhì)譜條件

3.3Western blot 檢測目標(biāo)蛋白對出生后1 d、2 d、4 d、8 d和15 d的正常大鼠觀察腦室周圍區(qū)域EAAT1和EAAT2發(fā)育期表達動態(tài)變化；對缺氧后4 h和1 d的各組大鼠檢測該區(qū)域EAAT1、EAAT2、Iba-1、IL-1β、TNF-α和TGF-β1蛋白表達情況。腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g)后斷頭取腦，分離腦室周圍區(qū)域。每組取處理過的蛋白樣品20 μg進行SDS-PAGE，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5%脫脂牛奶封閉1 h后結(jié)合I抗，室溫孵育1 h，4 ℃過夜。第2天結(jié)合含有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的II抗，室溫孵育2 h。Bio-Rad Chemical XRS+顯影系統(tǒng)掃描，用ImageJ 3.0軟件測量所有目標(biāo)蛋白以及內(nèi)參照的灰度值。

4統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性和方差齊性檢驗后發(fā)現(xiàn)，數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，因此采用非參數(shù)的Mann-Whitney和Wilcoxon檢驗對兩樣本進行統(tǒng)計學(xué)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1EAAT1和EAAT2發(fā)育期動態(tài)變化

2缺氧后4 h和1 d，米諾環(huán)素對腦室周圍區(qū)域谷氨酸及谷氨酸轉(zhuǎn)運體的作用

缺氧后4 h和1 d，對新生大鼠腦室周圍區(qū)域谷氨酸水平測定后發(fā)現(xiàn)谷氨酸水平持續(xù)增高(P<0.05)。給予米諾環(huán)素后，在缺氧后1 d，該區(qū)域谷氨酸水平顯著下降(P<0.05)。缺氧后4 h，EAAT2的表達明顯增加(P<0.05)，缺氧后1 d，EAAT1和EAAT2的表達均高于正常組(P<0.05)；Hy+M組與Hy組相比， EAAT1的表達升高(P<0.05)，而EAAT2的表達降低(P<0.05)，見圖3。結(jié)果提示缺氧早期，米諾環(huán)素能降低腦室周圍區(qū)域谷氨酸水平和EAAT2的表達，但同時促進EAAT1的上調(diào)。

3缺氧后4 h和1 d，米諾環(huán)素對腦室周圍區(qū)域炎癥反應(yīng)的作用

系統(tǒng)性缺氧后4 h和1 d，腦室周圍區(qū)域IL-1β的表達持續(xù)增高(P<0.05)。在缺氧后1 d，該區(qū)域Iba-1以及TGF-β1的表達也上升(P<0.05)。給予米諾環(huán)素后，IL-1β、Iba-1及TGF-β1的表達均沒有變化，但TNF-α的表達卻升高(P<0.05)，見圖4。結(jié)果提示米諾環(huán)素未能干預(yù)缺氧后早期腦室周圍區(qū)域的炎癥反應(yīng)。

Figure 2.The time course of EAAT1 (A) and EAAT2 (B) protein expression in the periventricular zone. Mean±SD.n=7～8.**P<0.01vspostnatal 15 d group.

圖2腦室周圍區(qū)域EAAT1和EAAT2發(fā)育期動態(tài)變化

Figure 3.The effect of minocycline on glutamate level (A) and the protein expression of EAAT1 (B) and EAAT2 (C) in the periventricular zone after 4 h and 1 d of hypoxic exposure. Mean±SD.n=3～7.*P<0.05vsNG;#P<0.05vsHy.

圖3米諾環(huán)素對缺氧后腦室周圍區(qū)域谷氨酸以及谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT1和EAAT2的作用

討論

缺氧后，谷氨酸水平升高所介導(dǎo)的興奮性毒性作用能導(dǎo)致腦室周圍區(qū)域受損。因此維持該區(qū)域谷氨酸水平的穩(wěn)定，對HIE患兒在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和認(rèn)知功能的改善都有著重要作用。本實驗通過對新生大鼠系統(tǒng)性缺氧構(gòu)建HIE動物模型，探討米諾環(huán)素對缺氧后腦室周圍區(qū)域谷氨酸清除的作用及其可能的機制。

本研究發(fā)現(xiàn)腦室周圍區(qū)域，EAAT1和EAAT2在出生后第1周表達水平較低，可能與出生后第1周谷氨酸轉(zhuǎn)運體的啟動子快速下調(diào)有關(guān)[7]。由于谷氨酸轉(zhuǎn)運體在出生后低表達，新生大鼠在出生早期經(jīng)系統(tǒng)性缺氧后，是否更易引起谷氨酸水平升高，據(jù)此我們測定了該區(qū)域缺氧后早期谷氨酸水平的動態(tài)變化。

Figure 4.The effect of minocycline on the protein expression of Iba-1 (A), IL-1β (B), TGF-β1 (C) and TNF-α (D) in the periventricular zone after 4 h and 1 d of hypoxic exposure. Mean±SD.n=6～9.*P<0.05vsNG;#P<0.05vsHy.

圖4米諾環(huán)素對缺氧后腦室周圍區(qū)域炎癥介質(zhì)Iba-1、IL-1β、TNF-α和抗炎因子TGF-β1的作用

結(jié)果揭示缺氧后該區(qū)域谷氨酸水平升高，給予米諾環(huán)素后能下調(diào)谷氨酸水平。因此，本研究進一步對該區(qū)域炎癥介質(zhì)和谷氨酸轉(zhuǎn)運體的表達進行觀察，探討缺氧后早期米諾環(huán)素減輕谷氨酸水平的病理生理學(xué)機制。

EAAT1和EAAT2在缺氧后所發(fā)揮的作用有所不同。出生后早期EAAT1主要負(fù)責(zé)谷氨酸轉(zhuǎn)運[8]，它能清除腦內(nèi)多余的谷氨酸。2013年Nijboer等[8]發(fā)現(xiàn)，G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2，GRK2)敲除的小鼠經(jīng)HI造模后腦損傷程度明顯輕于野生型小鼠, 該保護機制與GRK2缺失后，星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上EAAT1表達增多、清除谷氨酸能力增強有關(guān)。相反缺氧后，EAAT2則表現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)運作用[9]，可將胞內(nèi)的谷氨酸釋放到組織間隙，提高谷氨酸水平。體外實驗也證實，少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)后，給予EAAT2特異性拮抗劑二氫卡因酸鹽(dihydrokainate，DHK)，能顯著抑制胞外谷氨酸的產(chǎn)生，并降低少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞死亡的數(shù)量[10]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)缺氧后4 h，谷氨酸水平升高可能與EAAT2高表達有關(guān)，因為缺氧后它可能發(fā)揮了逆轉(zhuǎn)運作用。近年來對米諾環(huán)素的研究中，Colovic等[11]發(fā)現(xiàn)給藥后4 h腦內(nèi)米諾環(huán)素的濃度逐漸上升，并在6 h后其血藥濃度逐漸達到穩(wěn)定。因此缺氧后4 h，米諾環(huán)素未對谷氨酸及其轉(zhuǎn)運體產(chǎn)生影響，這可能與其還未及時透過血腦屏障到達中樞，未對它們進行調(diào)控有關(guān)。因此，缺氧后1 d，米諾環(huán)素能降低谷氨酸水平，這也許與其促進EAAT1(負(fù)責(zé)將谷氨酸轉(zhuǎn)運入胞)表達的同時抑制EAAT2(負(fù)責(zé)將谷氨酸轉(zhuǎn)運出胞)有關(guān)。

缺氧后早期腦室周圍區(qū)域炎癥介質(zhì)表達增多，反映該區(qū)域炎癥反應(yīng)可能是一個早期過程；此時谷氨酸水平升高，提示谷氨酸的產(chǎn)生與炎癥反應(yīng)可能存在聯(lián)系。最近Wixey[6, 12]團隊對出生后3 d的新生大鼠進行右側(cè)頸總動脈結(jié)扎后，經(jīng)系統(tǒng)性缺氧構(gòu)建HIE動物模型，同樣在缺氧后2 h給予米諾環(huán)素發(fā)現(xiàn)在造模后第1周和第6周，其能抑制皮質(zhì)、丘腦和中縫背核部位的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)。在我們的模型中按相同的給藥方式和給藥劑量后觀察到，米諾環(huán)素未能干預(yù)腦室周圍區(qū)域炎癥介質(zhì)的表達，這可能與觀察部位的解剖結(jié)構(gòu)[13]，新生大鼠不同腦區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化后功能及其對神經(jīng)元的毒性作用存在差異[14]，造模的方式和觀察的時點不同有關(guān)，其具體機制還需進一步研究。近期有研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞能表達TGF-β1[15]，而TGF-β1陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞在機體中起到抗炎、抗氧化、保護受損后的神經(jīng)元的作用。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧后TGF-β1表達增加，或許與EAAT1一樣，是機體面對損傷后的代償反應(yīng)。Boycott等[4]在對培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞進行缺氧后發(fā)現(xiàn)有大量TNF-α產(chǎn)生，而TNF-α對EAAT1和EAAT2具有選擇性作用，它能顯著性抑制EAAT2的產(chǎn)生，但不能對EAAT1的表達產(chǎn)生影響。在我們研究中發(fā)現(xiàn)給予米諾環(huán)素后，TNF-α表達上升，而EAAT2的表達卻下降。這說明米諾環(huán)素對EAAT2表達的調(diào)控可能與其促進該區(qū)域TNF-α水平升高存在關(guān)聯(lián)。

綜上所述，缺氧后早期米諾環(huán)素能降低腦室周圍區(qū)域谷氨酸水平，其作用機制可能與其選擇性調(diào)控谷氨酸轉(zhuǎn)運體(促進EAAT1表達的同時抑制了EAAT2)，而非抑制該區(qū)域炎癥反應(yīng)有關(guān)。通過降低該區(qū)域谷氨酸水平，減輕由谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性作用，將有助于改善HIE患兒神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂和認(rèn)知能力障礙。在今后的研究中，我們將進一步證實米諾環(huán)素選擇性地調(diào)控谷氨酸轉(zhuǎn)運體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，為其在臨床治療HIE提供更有力的證據(jù)。

[參考文獻]

[1]Suryana E, Jones NM. The effects of hypoxic preconditioning on white matter damage following hypoxic-ischaemic injury in the neonatal rat brain[J]. Int J Dev Neurosci, 2014, 37:69-75.

[2]Loeliger M, Watson CS, Reynolds JD, et al. Extracellular glutamate levels and neuropathology in cerebral white matter following repeated umbilical cord occlusion in the near term fetal sheep[J]. Neuroscience, 2003, 116(3):705-714.

[3]Olmos G, Lladó J. Tumor necrosis factor alpha: a link between neuroinflammation and excitotoxicity[J]. Mediators Inflamm, 2014, 2014:861231.

[4]Boycott HE, Wilkinson JA, Boyle JP, et al. Differential involvement of TNF alpha in hypoxic suppression of astrocyte glutamate transporters[J]. Glia, 2008, 56(9):998-1004.

[5]Kaur C, Sivakumar V, Zou Z, et al. Microglia-derived proinflammatory cytokines tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1beta induce Purkinje neuronal apoptosis via their receptors in hypoxic neonatal rat brain[J]. Brain Struct Funct, 2014, 219(1):151-170.

[6]Wixey JA, Reinebrant HE, Spencer SJ, et al. Efficacy of post-insult minocycline administration to alter long-term hypoxia-ischemia-induced damage to the serotonergic system in the immature rat brain[J]. Neuroscience, 2011, 182:184-192.

[7]Regan MR, Huang YH, Kim YS, et al. Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS[J]. J Neurosci, 2007, 27(25):6607-6619.

[8]Nijboer CH, Heijnen CJ, Degos V, et al. Astrocyte GRK2 as a novel regulator of glutamate transport and brain damage[J]. Neurobiol Dis, 2013, 54:206-215.

[9]Back SA, Rosenberg PA. Pathophysiology of glia in perinatal white matter injury[J]. Glia, 2014, 62(11):1790-1815.

[10]Deng W, Rosenberg PA, Volpe JJ, et al. Calcium-permeable AMPA/kainate receptors mediate toxicity and preconditioning by oxygen-glucose deprivation in oligodendrocyte precursors[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(11):6801-6806.

[11]Colovic M, Caccia S. Liquid chromatographic determination of minocycline in brain-to-plasma distribution studies in the rat[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2003, 791(1-2):337-343.

[12]Wixey JA, Reinebrant HE, Buller KM. Inhibition of neuroinflammation prevents injury to the serotonergic network after hypoxia-ischemia in the immature rat brain[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 2011, 70(1):23-35.

[13]Hou G, Yang X, Yuan TF. Hippocampal asymmetry: differences in structures and functions[J]. Neurochem Res, 2013, 38(3):453-460.

[14]Lai AY, Dhami KS, Dibal CD, et al. Neonatal rat microglia derived from different brain regions have distinct activation responses[J]. Neuron Glia Biol, 2011, 7(1):5-16.

[15]Butovsky O, Jedrychowski MP, Moore CS, et al. Identification of a unique TGF-beta-dependent molecular and functional signature in microglia[J]. Nature Neurosci, 2014, 17(1):131-143.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effect of minocycline on glutamate uptake in periventricular zone of neonatal rats after hypoxiaLI Hong-chun1, LI Xia1, MA Xue-tao2, XIAO Jie1，3, NIU Zhi-rui2, FENG Lei2, LI Fan1

(1DepartmentofPathologyandPathophysiology,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China;2YunnanTestingInstituteforProductQualitySupervision,Kunming650223,China；3DepartmentofPathology,HuangshiCentralHospital,Huangshi435000,China.E-mail:leefan623@sina.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of minocycline on glutamate uptake in the periventricular zone and its putative mechanism after hypoxic exposure in neonatal rats. METHODS: A model of hypoxic-ischemic brain damage (HIBD) was developed by putting postnatal 1 d rat pups in 5% O2for 3.5 h. The glutamate level in periventricular zone was measured by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry assay (LC-MS/MS) after hypoxic exposure for 4 h and 1 d. The dynamic changes of glutamate transporters EAAT1, and EAAT2 during developmental period in periventricular zone were determined by Western blot. Moreover, the expression of EAAT1, EAAT2, Iba-1, IL-1β, TNF-α and TGF-β1 was also detected by Western blot after hypoxic exposure for 4 h and 1 d in that region. The effects of minocycline on all parameters mentioned above were tested after minocycline treatment at the same time points and in the same region. RESULTS: After hypoxic exposure, glutamate level was increased, but it was decreased after minocycline treatment. EAAT1 and EAAT2 kept a low expression level at the first postnatal week, but a predominant elevation was found at the end of the second postnatal week. The expression of EAAT1, EAAT2, Iba-1, IL-1β and TGF-β1 was increased at 1 d after hypoxic exposure. EAAT1 and TNF-α expression was significantly up-regulated, while EAAT2 was down-regulated after minocycline treatment. CONCLUSION: Minocycline inhibits the increase in the glutamate level after hypoxia in periventricular region of the neonatal rats. The mechanism may relate to the selective regulation of glutamate transporters, rather than the inhibition of neuroinflammation in periventricular zone.

[KEY WORDS]Minocycline; Periventricular zone; Hypoxia; Glutamate; Glutamate transporters

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.017

[中圖分類號]R363

[文獻標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel： 0871-65922858; E-mail: leefan623@sina.com

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81200939; No. 31260242)；云南省科技計劃(No. 2011FB060)

[收稿日期]2015- 08- 27[修回日期] 2015- 11- 25

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0290- 06