岳莉英，　關(guān)志明，　裴志強(qiáng)

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院1心內(nèi)科，2呼吸科，3太原市中心醫(yī)院心內(nèi)科，山西 太原 030001)

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內(nèi)皮源性吲哚胺2,3-雙加氧酶抑制周細(xì)胞遷移及收縮蛋白表達(dá)

岳莉英1△，關(guān)志明2，裴志強(qiáng)3

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院1心內(nèi)科，2呼吸科，3太原市中心醫(yī)院心內(nèi)科，山西 太原 030001)

[摘要]目的： 探討內(nèi)皮源性吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)對周細(xì)胞遷移及收縮蛋白表達(dá)的影響。方法: 體外培養(yǎng)人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HPAECs)及大鼠腦微血管周細(xì)胞。建立過表達(dá)IDO的HPAECs模型(IDO-HPAECs)。實(shí)驗(yàn)分為3組：對照組，以HPAECs條件培養(yǎng)基干預(yù)周細(xì)胞；處理組，以IDO-HPAECs條件培養(yǎng)基干預(yù)周細(xì)胞；抑制組，以含1-甲基色氨酸(1-mT)的IDO-HPAECs條件培養(yǎng)基干預(yù)周細(xì)胞。測定共培養(yǎng)體系一氧化氮(NO)、色氨酸及犬尿氨酸濃度。觀察周細(xì)胞活性、遷移及收縮蛋白表達(dá)情況。結(jié)果: IDO-HPAECs條件培養(yǎng)基干預(yù)周細(xì)胞6～48 h對其活性無顯著影響。處理組的周細(xì)胞遷移能力顯著低于對照組(P<0.01)，抑制組顯著高于處理組(P<0.01)。共培養(yǎng)體系的NO濃度在各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。處理組的色氨酸濃度顯著低于對照組(P<0.01)，而抑制組顯著高于處理組(P<0.01)。處理組的犬尿氨酸濃度顯著高于對照組(P<0.01)，而抑制組顯著低于處理組(P<0.01)。處理組的α-平滑肌肌動蛋白與結(jié)蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組(P<0.01)，抑制組顯著高于處理組(P<0.01)。結(jié)論: 內(nèi)皮源性IDO抑制周細(xì)胞遷移及收縮蛋白表達(dá)，可能參與機(jī)體微血管功能調(diào)控。

[關(guān)鍵詞]吲哚胺2, 3-雙加氧酶； 內(nèi)皮細(xì)胞； 周細(xì)胞

肺動脈高壓是嚴(yán)重危害人體健康的疾病，血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞功能改變是影響肺動脈高壓進(jìn)展的重要因素。近年來研究顯示：內(nèi)皮源性吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)通過將色氨酸代謝為犬尿氨酸舒張動脈血管并參與血壓調(diào)節(jié)[1]。最近有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮源性IDO可調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞表型改變,抑制血管重塑，從而減緩肺動脈高壓的進(jìn)展[1-2]。周細(xì)胞參與調(diào)控微血管血流[3]，與內(nèi)皮細(xì)胞之間通過間隙連接進(jìn)行信號傳遞，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖及遷移等病理生理學(xué)過程[4]。由此我們推測內(nèi)皮源性IDO也可能對周細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，進(jìn)而參與微血管系統(tǒng)血流調(diào)控。本研究在體外探討內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)IDO對周細(xì)胞增殖、遷移及收縮功能的影響。

材料和方法

1材料

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ScienCell)；兔抗大鼠β-actin、血小板衍生生長因子受體β(platelet-derived growth factor receptor-β，PDGFR-β)、神經(jīng)元膠質(zhì)抗原2(neuron-glial antigen 2，NG2)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和結(jié)蛋白抗體，小鼠抗人血管內(nèi)皮鈣黏素(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)和IDO抗體,ECL發(fā)光試劑盒(Santa Cruz)；一氧化氮(nitric oxide，NO)檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司；細(xì)胞裂解液及小鼠抗人β-actin抗體(CST)；Transwell系統(tǒng)(Corning)；1-甲基色氨酸(1-methyl-DL-tryptophan，1-mT)購自Sigma；ViraPower腺病毒表達(dá)系統(tǒng)試劑盒(Life Technologies)；3周齡雄性Wistar大鼠(10只)購自山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)太原市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary artery endothelial cells，HPAECs)株購自ScienCell。采用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。構(gòu)建高表達(dá)IDO的腺病毒載體及其對照的重組腺病毒表達(dá)載體。具體方法參照試劑盒說明書。通過感染HPAECs 60 h建立高表達(dá)IDO的內(nèi)皮細(xì)胞株(IDO-HPAECs)。腦微血管周細(xì)胞原代分離自3周齡雄性Wistar大鼠，采用2次酶消化及1次密度梯度離心分離腦微血管片段，進(jìn)行原代培養(yǎng)并鑒定，具體步驟參照文獻(xiàn)[5]。采用DMEM培養(yǎng)基，添加物包括谷氨酰胺(2 mmol/L)及雙抗(青霉素1×105U/L，鏈霉素100 mg/L)。以上細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的孵箱中，經(jīng)免疫學(xué)鑒定后使用3～7代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對照組(以HPAECs條件培養(yǎng)基干預(yù)周細(xì)胞)、處理組(以IDO-HPAECs條件培養(yǎng)基干預(yù)周細(xì)胞)和抑制組(以含1 mmol/L 1-mT的IDO-HPAECs條件培養(yǎng)基干預(yù)周細(xì)胞)。

2.2周細(xì)胞活力的測定考察過表達(dá)IDO的HPAECs條件培養(yǎng)基是否會影響周細(xì)胞活力。取對數(shù)生長期的周細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)接種于96孔板。各孔加入200 μL不同IDO-HPAECs培養(yǎng)時(shí)間(0 h、6 h、12 h、24 h和48 h)的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，每份設(shè)5個(gè)復(fù)孔，20 h后每孔加入5 g/L的四甲基偶氮唑鹽(MTT)20 μL，培養(yǎng)4 h。棄上清后，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，混勻10 min。采用多功能酶標(biāo)儀檢測570 nm處吸光度(A)值。以對照組(0 h)周細(xì)胞活性為100%，各處理組：細(xì)胞活力(%)=(處理孔A值/對照孔A值)×100%。

2.3周細(xì)胞遷移的測定采用Transwell系統(tǒng)進(jìn)行HPAECs與周細(xì)胞共培養(yǎng)。先將HPAECs以1×105/cm2密度接種于Transwell系統(tǒng)下層，待細(xì)胞生長至匯合后再將周細(xì)胞以同樣密度接種于8 μm孔嵌套膜上層。共培養(yǎng)48 h后，用棉簽將仍位于嵌套膜上層的周細(xì)胞拭去。將嵌套膜取出，0.1%結(jié)晶紫(溶于20%乙醇)染色。顯微鏡下觀察遷移至嵌套膜底面的周細(xì)胞。每孔取5個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)，每種處理設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2.4共培養(yǎng)體系活性物質(zhì)的測定共培養(yǎng)48 h后，采用硝酸還原酶法檢測共培養(yǎng)體系中培養(yǎng)液上清NO濃度。采用高效液相色譜法檢測培養(yǎng)液上清色氨酸與犬尿氨酸濃度。每種處理設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

2.5Western blot實(shí)驗(yàn)鑒定IDO-HPAECs模型及分析周細(xì)胞收縮蛋白表達(dá)情況后者以3組不同的條件培養(yǎng)基干預(yù)周細(xì)胞24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將細(xì)胞裂解物以20 μg蛋白上樣于10% SDS凝膠進(jìn)行電泳分離，濕法轉(zhuǎn)印于PVDF膜上。5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉，I 抗4 ℃過夜。以相應(yīng) II 抗孵育后，最終以ECL試劑盒產(chǎn)生光信號。分別檢測內(nèi)皮細(xì)胞IDO、β-actin與周細(xì)胞α-SMA、結(jié)蛋白及β-actin表達(dá)情況。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1HPAECs與周細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察與鑒定

相差顯微鏡下，HPAECs細(xì)胞呈多邊形、邊界清，細(xì)胞核位于中央(圖1A)；經(jīng)鑒定，VE-cadherin特異性表達(dá)于細(xì)胞膜上(圖1B)。周細(xì)胞體積大、形狀不規(guī)則，周邊常見突起，匯合后接觸抑制不明顯(圖1C)；經(jīng)鑒定，PDGFR-β與NG2陽性表達(dá)(圖1D～F)。

Figure 1.Morphology and identification of HPAECs and pericytes. A: HPAECs under phase-contrast microscope; B: VE-cadherin expressed on the membrane of HPAECs; C: the pericytes under phase-contrast microscope; D: the positive expression of PDGFR-β; E: the positive expression of NG2; F: merged image of D and E.

圖1HPAECs與周細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與鑒定

2IDO-HPAECs條件培養(yǎng)基對周細(xì)胞活力的影響

觀察不同培養(yǎng)時(shí)間IDO-HPAECs 條件培養(yǎng)基對周細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明周細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)間分別為6 h、12 h、24 h及48 h的條件培養(yǎng)基作用下，細(xì)胞活力在各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且接近對照組，可用于進(jìn)一步研究，見圖2。

Figure 2.The effects of conditioned medium of IDO-HPAECs on the viability of pericytes. Mean±SD.n=5.

圖2IDO-HPAECs條件培養(yǎng)基對周細(xì)胞活性的影響

3內(nèi)皮源性IDO對周細(xì)胞遷移的影響

HPAECs與周細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，對照組遷移至嵌套膜底面的單視野周細(xì)胞數(shù)為376.3±20.5。過表達(dá)IDO的處理組單視野周細(xì)胞數(shù)為154.4±16.1，顯著低于對照組(P<0.01)。含有1-mT的抑制組單視野周細(xì)胞數(shù)為347.9±17.8，顯著高于抑制組(P<0.01)，見圖3。

4共培養(yǎng)體系NO、色氨酸及犬尿氨酸濃度測定

HPAECs與周細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)基上清液中NO濃度在3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。處理組色氨酸濃度顯著低于對照組(P<0.01)，而抑制組色氨酸濃度則顯著高于處理組(P<0.01)。相反的，處理組犬尿氨酸濃度顯著高于對照組(P<0.01)，而抑制組犬尿氨酸濃度顯著低于處理組(P<0.01)，見圖4。

5內(nèi)皮源性IDO對周細(xì)胞收縮蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)攜帶IDO的腺病毒載體轉(zhuǎn)染HPAECs后，可見IDO蛋白的高表達(dá)。對照HPAECs及空載體轉(zhuǎn)染表達(dá)量很低。經(jīng)條件培養(yǎng)基處理后的周細(xì)胞，與對照組相比，處理組α-SMA與結(jié)蛋白表達(dá)水平顯著降低。與處理組相比，抑制組α-SMA與結(jié)蛋白表達(dá)水平顯著增高，見圖5。

討論

多種病因?qū)е路蝿用}高壓時(shí)均存在炎癥反應(yīng)。當(dāng)炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞IDO可催化色氨酸代謝為犬尿氨酸，與一氧化氮合酶2(nitric oxide syn-thase 2, NOS2)催化精氨酸產(chǎn)生的NO協(xié)同調(diào)節(jié)血管平滑肌張力[6]。在小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)內(nèi)毒素導(dǎo)致炎癥反應(yīng)時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞IDO表達(dá)增高，可降低血漿色氨酸濃度并提高犬尿氨酸水平，繼而引發(fā)低血壓[1]。當(dāng)前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)在于內(nèi)皮源性IDO對血管平滑肌細(xì)胞可塑性的調(diào)控。其實(shí)驗(yàn)依據(jù)在于自肺動脈高壓患者或?qū)嶒?yàn)性肺高血壓動物體內(nèi)分離、培養(yǎng)的具有病理表型的平滑肌細(xì)胞在體外可經(jīng)過外界信號的誘導(dǎo)恢復(fù)生理表型[7-8]。

Figure 3.The effects of endothelial IDO on the migration of pericytes (crystal violet staining, ×100). Mean±SD.n=15.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vstreatment group.

圖3內(nèi)皮源性IDO對周細(xì)胞遷移的影響

Figure 4.Detection of NO, tryptophan and kynurenine in the co-culture system. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vstreatment group.

圖4共培養(yǎng)體系NO、色氨酸及犬尿氨酸濃度測定

周細(xì)胞通過許多長的突起環(huán)繞微血管壁，并與內(nèi)皮細(xì)胞共用基底膜[9-10]。周細(xì)胞對微血流的調(diào)控作用依賴于其類平滑肌的收縮特性[11-12]。目前未見內(nèi)皮細(xì)胞通過IDO與周細(xì)胞相互作用的報(bào)道。本研究利用Transwell系統(tǒng)觀察周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)的遷移情況。結(jié)果表明，與過表達(dá)IDO的HPAECs共培養(yǎng)的周細(xì)胞遷移能力顯著下降，而此現(xiàn)象并非由于其細(xì)胞活力下降所致。此外，應(yīng)用IDO抑制劑1-mT可逆轉(zhuǎn)IDO-HPAECs條件培養(yǎng)基對周細(xì)胞遷移的抑制作用。提示內(nèi)皮細(xì)胞可通過表達(dá)IDO對其周圍的細(xì)胞(周細(xì)胞)產(chǎn)生作用，影響其生物學(xué)行為。我們同時(shí)檢測了共培養(yǎng)體系中NO、色氨酸及犬尿氨酸的濃度。其中，NO濃度在3組中未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明NOS系統(tǒng)不是引起本研究模型中周細(xì)胞生物學(xué)行為變化的原因。色氨酸及犬尿氨酸的濃度在各組中的相應(yīng)變化與IDO將色氨酸代謝為犬尿氨酸的過程相一致。

為確定內(nèi)皮細(xì)胞是否可能通過IDO影響周細(xì)胞的舒縮行為并進(jìn)而調(diào)控微血管的血流，我們觀察了IDO-HPAECs條件培養(yǎng)基對α-SMA及結(jié)蛋白2種與收縮行為相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)IDO后，內(nèi)皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可下調(diào)周細(xì)胞α-SMA及結(jié)蛋白表達(dá)，而應(yīng)用1-mT后可部分減輕IDO對α-SMA及結(jié)蛋白表達(dá)的抑制。提示內(nèi)皮細(xì)胞可能通過表達(dá)IDO調(diào)控周細(xì)胞的舒縮行為。

Figure 5.The effects of endothelial IDO on the expression of contractile proteins in the pericytes. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHPAECs alone;##P<0.01vsHPAECs+vehicle;△△P<0.01vscontrol group;▲▲P<0.01vstreatment group.

圖5內(nèi)皮源性IDO對周細(xì)胞收縮蛋白表達(dá)的影響

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮源性IDO可能通過調(diào)控周細(xì)胞收縮蛋白的表達(dá)影響包括遷移在內(nèi)的生物學(xué)行為，為深入研究周細(xì)胞調(diào)控微血管血流的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為肺動脈高壓研究提供了新的方向。然而本研究在這一新領(lǐng)域中僅為細(xì)胞水平的初步探索，在動物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞學(xué)中深入研究IDO是如何作用于周細(xì)胞及可能的分子機(jī)制，會有更積極的意義。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Endothelial indoleamine 2,3-dioxygenase inhibits migration and expression of contractile proteins in pericytesYUE Li-ying1, GUAN Zhi-ming2, PEI Zhi-qiang3

(1DepartmentofCardiology，2DepartmentofRespiration,TheSecondHospitalofShanxiMedicalUniversity;3DepartmentofCardiology,TaiyuanCentralHospital,Taiyuan030001,China.E-mail:yly6673@sina.cn)

[ABSTRACT]AIM: To explore the effects of endothelial indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) on the migration and the expression of contractile proteins in the pericytes. METHODS: Human pulmonary artery endothelial cells (HPAECs) and rat cerebral microvascular pericytes were culturedinvitro. Over-expression of IDO in the HPAECs (IDO-HPAECs) was established. The pericytes were treated with HPAEC-conditioned medium (control group), IDO-HPAEC conditioned medium (treatment group), or IDO-HPAECs-conditioned medium containing 1-methyl-DL-tryptophan (1-mT) (inhibition group). The concentrations of nitric oxide (NO), tryptophan and kynurenine in the co-culture system were determined. The viability, migration and the expression of the contractile proteins in the pericytes were compared. RESULTS: No statistical difference of the pericyte viability after treatment with IDO-HPAEC-conditioned medium at 6～48 h was observed (P>0.05). The migratory ability of the pericytes significantly decreased in treatment group compared with control group (P<0.01), and significantly increased in inhibition group compared with treatment group (P<0.01). The concentration of NO in the co-culture system had no significant difference among groups (P>0.05). The concentration of tryptophan was significantly lower in treatment group than that in control group (P<0.01), and significantly higher in inhibition group than that in treatment group (P<0.01). The concentration of kynurenine was significantly higher in treatment group than that in control group (P<0.01), and significantly lower in inhibition group than that in treatment group (P<0.01). The expression of α-smooth muscle actin and desmin was significantly lower in treatment group than that in control group (P<0.01), and significantly higher in inhibition group than that in treatment group (P<0.01). CONCLUSION: Endothelial IDO inhibits the migration and the expression of the contractile proteins in the pericytes, and may play essential roles in the regulation of microvasculatures.

[KEY WORDS]Indoleamine 2,3-dioxygenase; Endothelial cells; Pericytes

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.011

[中圖分類號]R543；R363.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 0351-3365536; E-mail: yly6673@sina.cn

[收稿日期]2015- 07- 17[修回日期] 2015- 10- 10

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0256- 05