劉　亮　高　超　姚　平　宮智勇

(武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北　武漢　430023)

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槲皮素對動脈粥樣硬化小鼠自噬蛋白表達的影響

劉亮高超1姚平2宮智勇

(武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023)

〔摘要〕目的探討槲皮素對高脂膳食誘導(dǎo)動脈粥樣硬化(AS)小鼠自噬相關(guān)蛋白表達的影響。方法采用高脂高膽固醇膳食喂養(yǎng)apoE-/-小鼠24 w，建立AS模型，同時給予三個劑量槲皮素干預(yù)。飼養(yǎng)結(jié)束后處死動物，分離主動脈，用油紅O染色檢測主動脈脂質(zhì)沉積；用Western印跡方法檢測主動脈組織中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p62和溶酶體相關(guān)膜蛋白2(LAMP-2)的蛋白表達變化。結(jié)果與模型組小鼠相比，100 mg/kg體重的槲皮素干預(yù)可顯著減少(P<0.05)小鼠主動脈脂質(zhì)浸潤并緩解AS損傷，而50 mg/kg體重和100 mg/kg體重槲皮素干預(yù)均能使AS小鼠主動脈組織中mTOR、p62和LAMP-2蛋白表達顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論高脂膳食誘導(dǎo)的小鼠自噬功能損傷可能是AS的發(fā)病機制之一，槲皮素可通過自噬調(diào)節(jié)功能緩解AS損傷。

〔關(guān)鍵詞〕槲皮素；動脈粥樣硬化；自噬；溶酶體

1中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所

2華中科技大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系

第一作者：劉亮(1979-)，男，博士，講師，碩士生導(dǎo)師，主要從事食品營養(yǎng)研究。

黃酮類化合物可降低心腦血管疾病(CVD)風(fēng)險〔1〕。Macready等〔2〕的最新研究也發(fā)現(xiàn)，富含黃酮類化合物的水果和蔬菜的攝入量與CVD事件顯著相關(guān)。槲皮素及其衍生物廣泛存在于植物的花、葉、果實當(dāng)中，也是人類飲食中最主要的生物類黃酮(約占膳食總黃酮攝入量的60%～75%)。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素與其他黃酮類化合物相比，在預(yù)防動脈粥樣硬化(AS)發(fā)生發(fā)展過程中似乎具有更加優(yōu)越的性能〔3〕。利用自行合成的單抗，Kawai〔4〕發(fā)現(xiàn)，槲皮素可選擇性地富集于AS斑塊內(nèi)活化的巨噬細胞中而非正常的動脈組織，為槲皮素的抗AS效應(yīng)奠定了直接的物質(zhì)基礎(chǔ)。但槲皮素預(yù)防AS的分子機制至今仍未詳盡闡明。因此，本研究采用高脂膳食喂養(yǎng)載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠建立AS模型，并同時進行槲皮素干預(yù)，探討槲皮素對高脂誘導(dǎo)AS的保護效應(yīng)及其相關(guān)機制。

1材料與方法

1.1主要試劑槲皮素(≥95%)購于美國sigma公司；兔抗雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗體、兔抗p62抗體、HRP標(biāo)記抗兔IgG抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗小鼠IgG抗體、HRP標(biāo)記抗大鼠IgG抗體均購自美國Cell Signal公司；大鼠抗LAMP-2抗體購自美國santa cruz公司；小鼠抗GAPDH抗體購自博士德生物有限公司。

1.2實驗動物75只6周齡雄性ApoE-/-小鼠以及15只相同遺傳背景下野生型C57BL/6小鼠，體重(18±2)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.3動物分組及模型建立50只ApoE-/-小鼠在SPF級動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機分為普通飼料組(ND)、高脂組(HFD)、低(25 mg/kg體重)、中(50 mg/kg體重)、高(100 mg/kg體重)三個劑量槲皮素干預(yù)組(HFD+LQR、HFD+MQR、HFD+HQR組)，高脂飼料配方含膽固醇1.25%，脂肪21%〔5〕；以10只相同遺傳背景下野生型C57BL/6小鼠為對照組(CT)，持續(xù)喂養(yǎng)24 w。實驗期間每周稱量體重和進食量。所有小鼠均按照動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)于同濟醫(yī)學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生系SPF級動物實驗室(SYXK鄂 2005-0033)，控制房間溫度(24±1)℃，明暗交替周期12/12 h。

1.4主動脈橫截面油紅O染色每組隨機抽取4只小鼠，以2%戊巴比妥鈉麻醉后，連同主動脈根部分離心臟，OCT包埋并于冰凍切片機(-20℃)切片，切片厚度為10 μm，油紅O染色后在顯微鏡下觀察血管內(nèi)壁脂質(zhì)浸潤情況，以紅色斑塊面積占主動脈管腔橫截面的面積(回歸標(biāo)準(zhǔn)圓形)的百分比代表AS病變的相對大小。

1.5小鼠主動脈組織中自噬相關(guān)蛋白表達檢測主動脈組織經(jīng)生理鹽水勻漿離心后，取上清采用改良Lowry法測定蛋白濃度后，以最低濃度組為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整蛋白濃度，取30~50 μg蛋白，經(jīng)8%~12%的SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，置5%牛奶室溫封閉2 h或者4℃過夜后，將膜分別置于兔抗鼠mTOR、LAMP-2、p62和內(nèi)參中4℃過夜或者室溫搖床孵育，用帶有HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG液孵育洗滌后的上述結(jié)合相應(yīng)一抗的PVDF膜1 h，洗膜后在膜上滴加ECL發(fā)光試劑約3~5 min，充分孵育后吸干發(fā)光試劑，將膜置于玻璃板上且在凝膠成像系統(tǒng)中成像。用Gel Pro 3.0軟件讀取條帶積分光密度值(OD)，以目的蛋白的OD值除以內(nèi)參條帶的OD值作為目的蛋白的相對OD值，每個蛋白至少取三組條帶進行分析。

2結(jié)果

2.1槲皮素對AS小鼠主動脈斑塊損傷面積的影響(油紅O染色)HFD組小鼠動脈管壁厚薄不均，脂質(zhì)浸潤嚴(yán)重，內(nèi)膜明顯增厚，管腔狹窄，內(nèi)膜處可見纖維組織增生，替代平滑肌細胞，可見由大量泡沫細胞形成的脂紋、脂斑；平滑肌細胞顯著增生，尚能見由纖維帽覆蓋的纖維斑塊期病變；血管內(nèi)可見明顯針狀膽固醇結(jié)晶。而ND組則表現(xiàn)出動脈壁完整，厚薄均勻，并且內(nèi)膜、中膜及外膜均未見明顯異常，基本無AS病灶；血管內(nèi)無血栓、膽固醇沉積；平滑肌細胞呈長條形、梭形，細胞核成橢圓形或梭形。與HFD組相比，三個劑量槲皮素干預(yù)后病變程度有所緩解，但依然有大量紅色脂滴浸潤和少量膽固醇結(jié)晶，其中高劑量槲皮素可顯著減少(P<0.05)脂質(zhì)浸潤。見表1，圖1。

2.2槲皮素對高脂膳食mTOR和p62蛋白表達的影響與ND組相比，HFD組小鼠主動脈組織中mTOR的蛋白表達顯著下降(P<0.01)。與HFD組相比，中、高劑量槲皮素干預(yù)后小鼠主動脈組織中的mTOR的蛋白表達進一步顯著下降(P<0.05)。HFD組小鼠p62的蛋白表達量雖高于ND組，但無統(tǒng)計學(xué)差異。與HFD組相比，槲皮素干預(yù)后p62的蛋白表達下調(diào)，但只有中、高劑量的槲皮素對p62的下調(diào)具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表1，圖2。

表1　槲皮素對小鼠主動脈斑塊面積和蛋白表達的影響±s,n=4)

與ND組比較：1)P<0.01;與HFD組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

圖1　主動脈橫截面油紅O染色(×100)及斑塊損傷面積分析

2.3槲皮素對高脂膳食LAMP-2蛋白表達的影響HFD組小鼠主動脈LAMP-2的蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.01)，槲皮素干預(yù)可抑制高脂膳食對LAMP-2的誘導(dǎo)作用，其中高劑量槲皮素對LAMP-2的抑制達到極顯著水平(P<0.01)。見表1，圖3。

圖2　槲皮素對mTOR和p62蛋白表達的影響

圖3　槲皮素對LAMP-2蛋白表達的影響

3討論

在本研究中，小鼠經(jīng)24 w高脂膳食后主動脈血管結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，并出現(xiàn)AS的典型特征，而槲皮素干預(yù)后可使該變化得以緩解。研究證實，槲皮素還可以降低高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟脂質(zhì)積累，降低與脂肪肝相關(guān)基因表達〔6〕，調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達〔7〕，提高巨噬細胞膽固醇輸出〔8〕，保護低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡〔9〕。本文發(fā)現(xiàn)，低、中劑量槲皮素干預(yù)后斑塊面積變化沒有顯著差異，這可能因為飼養(yǎng)周期過長，AS病變過于嚴(yán)重，槲皮素生物活性以不足以修復(fù)和逆轉(zhuǎn)由此造成的嚴(yán)重主動脈損傷；還有可能是因為小鼠的個體差異以及樣本量不夠多，以致顯著性被掩蓋。

自噬是細胞溶酶體代謝降解長壽蛋白和衰老受損細胞器等物質(zhì)且相對保守的生物過程，也是維持細胞穩(wěn)態(tài)和能量代謝的重要調(diào)節(jié)機制〔10〕。大量研究表明，多種疾病與自噬機制有關(guān)〔11〕。主動脈大量脂質(zhì)積累是AS的顯著特征，脂質(zhì)積累的泡沫細胞的形成是啟動AS形成的關(guān)鍵步驟〔12〕。目前，他汀類藥物被認為是臨床上穩(wěn)定AS斑塊的常用有效藥物，但是當(dāng)患者服用該類制劑后仍存在心血管疾病(CAD)的較大風(fēng)險，表明AS的有效預(yù)防仍面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)〔13〕。2009年首次發(fā)現(xiàn)自噬機制參與脂滴降解，自噬體可將脂滴輸送到溶酶體腔內(nèi)水解〔14〕。因此，自噬調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝成為一個新的研究領(lǐng)域。雖然Zhang等〔15〕用ox-LDL誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細胞后發(fā)現(xiàn)自噬-溶酶體途徑參與了ox-LDL吸收后的降解，但該結(jié)果只是在細胞水平上驗證，在體內(nèi)具體過程仍待深入研究。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是自噬的有效抑制劑，通過抑制mTOR可以作為治療CAD的有效方法〔16〕。由此可知，mTOR作為自噬的負調(diào)節(jié)蛋白，抑制mTOR的表達可以作為緩解晚期AS的有效方式〔17〕。本研究的結(jié)果與以上報道觀點一致，抑制mTOR可顯著活化自噬體〔18〕。本實驗條件下，高脂膳食可誘導(dǎo)自噬，而槲皮素干預(yù)使自噬能力得到進一步加強。

p62/SQSTM1是應(yīng)激可誘導(dǎo)蛋白，可以調(diào)節(jié)細胞生存和死亡的多個信號通路〔19〕，也是目前已知最好的自噬特異性底物和評價“自噬潮”最有效的標(biāo)記物〔20〕。Mathew等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)自噬損傷可導(dǎo)致p62大量積累。本研究結(jié)果顯示，高脂膳食并沒有引起小鼠肝臟和主動脈組織中p62積累，說明該模型下組織的自噬功能并沒有受到嚴(yán)重損傷，這可能與自噬的自我反饋修復(fù)機制有關(guān)。因為研究表明自噬可以調(diào)節(jié)p62蛋白表達水平，相反，p62也可以通過活化mTOR的方式抑制自噬〔19〕。本文中，中、高劑量槲皮素干預(yù)可顯著降低p62蛋白表達水平，這表明槲皮素干預(yù)可以促進自噬體形成〔18〕，并可能進一步通過增加自噬機制降解溶酶體內(nèi)的脂質(zhì)，而且這一變化趨勢與mTOR蛋白表達基本保持一致。

LAMP-2在介導(dǎo)溶酶體與自噬體融合中具有實質(zhì)性的作用〔15〕。在臨床調(diào)查的外周白細胞的CAD病人中，LAMP-2的基因和蛋白表達水平顯著增加，這表明溶酶體大量積累。這一結(jié)果也充分說明，溶酶體水解酶和蛋白表達不足，從而導(dǎo)致脂質(zhì)代謝和膽固醇異常，這可能也是造成CAD始發(fā)和進展的主要原因之一。對134例CAD病人外周白細胞溶酶體標(biāo)記蛋白LAMP-2分析發(fā)現(xiàn)，CAD病人外周白細胞LAMP-2的基因表達和蛋白表達水平顯著上升〔22〕。心肌梗死病人外周白細胞中LC3的基因和蛋白表達水平顯著降低，而LAMP-2的基因和蛋白表達水平顯著提高〔23〕，本研究LAMP-2蛋白表達趨勢與上述報道一致。

本研究表明，槲皮素在AS發(fā)病過程中對自噬具有明顯調(diào)節(jié)作用，這可能是槲皮素發(fā)揮預(yù)防AS發(fā)病的可能機制之一。

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〔2015-10-15修回〕

(編輯徐杰)

The effects of quercetin on the protein expression of autophagy in atherosclerotic mice

LIU Liang, GAO Chao, YAO Ping,etal.

College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, Hubei,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate protective role of quercetin against atherosclerosis via autophagy regulation in high-fat diets mice.MethodsApoE-/-mice were given high-fat diets and(or) three different doses of quercetin for 24 weeks. All the animals were sacrificed at the end of feeding, and the aortas were removed for red oil O staining in order to analyze the atherosclerotic lesions. The protein expressions of mTOR, p62 and LAMP-2 in aortic tissues were measured with Western blot.ResultsThe atherosclerotic lesions were alleviated and lipid infiltration was decreased in aortic(P<0.05) and quercetin-treated group (100 mg·kg-1·bw-1) as compared to high-fat diets group. The expressions of mTOR, p62 and LAMP-2 were significantly (P<0.05) reduced at translational level in quercetin-treated groups (50 and 100 mg·kg-1·bw-1). ConclusionsAutophagy dysfunction is the potential mechanism of atherosclerosis, and quercetin has the significant protective effects by autophagy regulation and alleviating atherosclerotic lesions.

【Key words】Quercetin; Atherosclerosis; Autophagy; Lysosome

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31201351，81172658)

〔中圖分類號〕TS201.4

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0539-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.010